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酶聯(lián)免疫法檢測試劑注冊技術審查指導原則
（食藥監(jiān)辦械函[2013]3號）

一、前言

本指導原則主要針對酶聯(lián)免疫類檢測試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)提出指導性技術要求。

本指導原則系對酶聯(lián)免疫法檢測試劑的一般要求，申請人應依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據(jù)。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善、科學技術的不斷發(fā)展，其相關內(nèi)容也將進行適時的調(diào)整。

二、適用范圍

本指導原則適用于有關病原微生物檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術審查。其他酶聯(lián)免疫法檢測試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導原則執(zhí)行。

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應制定其相應的質(zhì)量標準，并應符合有關法規(guī)的要求。

2.試劑生產(chǎn)企業(yè)應具備相應的專業(yè)技術人員、儀器設備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》;同時，應按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實施細則（試行）》的要求建立相應的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行;還應通過《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。企業(yè)應對試劑的使用范圍做出明確規(guī)定，并經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理部門批準。

3.診斷試劑的研制應當按照科學、規(guī)范的原則，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。

4.試劑在研制、生產(chǎn)過程中所用的各種材料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩(wěn)定、工藝可控、檢測有效。

（二）原材料質(zhì)量控制

1.主要生物原料

與產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標反應板、標記相關酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。使用前應按照工藝要求對這類生物原料進行質(zhì)量檢驗，以保證其達到規(guī)定的質(zhì)量標準。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩(wěn)定;若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據(jù)國家相關法規(guī)的要求進行變更申請。

主要生物原料的常規(guī)檢驗項目一般包括：

（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒;或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質(zhì);特殊生物原料應具備相應外觀標準。

（2）純度和分子量

主要經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據(jù)所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進行電泳，一般每個電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質(zhì)量標準，分子量大小應在正確的條帶位置。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進行檢測。

（4）效價

效價的測定一般根據(jù)蛋白含量測定結果，通過倍比稀釋法進行。效價應達到規(guī)定的要求。

（5）功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等，并比較其與上批次原料的相關性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質(zhì)量標準應符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準》規(guī)定的標準要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。建議作以下檢驗：

（1）牛血清或羊血清

外觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物。

無菌試驗：將血清直接37℃放置7天，明亮處觀察，不得出現(xiàn)混濁或沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化鈉溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外觀：應為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結塊，無肉眼可見的其它雜質(zhì)顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18~26℃時，溶解時間應≤15分鐘，pH值應為6.5~7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法，其標準為≥95%。

總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標準為≥90%。

（3）酪蛋白：

應符合生產(chǎn)所需的質(zhì)量標準。

（4）標記用酶

應在產(chǎn)品的質(zhì)量標準中明示所使用的標記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的檢驗方法和質(zhì)量標準進行檢驗，酶的純度RZ值（OD_403nm/OD_280nm）應大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行酶聯(lián)免疫測定，均不能出現(xiàn)非特異性反應。

生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。

3.化學原材料

化學原材料的質(zhì)量標準，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應符合《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準（2000年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。

主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發(fā)生變更?；瘜W原材料在購入時，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學原材料的質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗報告。

4.其他物料

酶標板

①外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質(zhì)量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應剔除。

②吸附能力和精密性

采用合適的方法進行檢驗。

一般用一定濃度的正常人免疫球蛋白G（IgG）包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結合物吸附，通過顯色反應，使用酶標儀讀數(shù)，計算CV值。CV值結果應符合相關產(chǎn)品的功能性質(zhì)量標準，一般批內(nèi)CV≤5%，批間CV≤10%。

（2）液體試劑裝量瓶

包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應有相應的裝量瓶，并建立相應的質(zhì)量控制標準，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規(guī)格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

（3）其他材料

包括試劑瓶標簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫(yī)療器械說明書、標簽和包裝標識管理規(guī)定》建立相應質(zhì)量控制標準。

5.企業(yè)質(zhì)控品

企業(yè)質(zhì)控品一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、鉤狀效應（hook效應）等質(zhì)控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質(zhì)控品樣品。如該產(chǎn)品具有國家標準品或參考品，應使用國家標準品（參考品）進行標化;若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則企業(yè)參考品的制備應有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

企業(yè)質(zhì)控品的基質(zhì)應與診斷試劑的待測樣品的基質(zhì)基本一致，如待測樣品為血清/血漿，質(zhì)控品基質(zhì)也應為血清/血漿。

（三）試劑盒各組分的生產(chǎn)

酶聯(lián)免疫法檢測試劑主要組分的生產(chǎn)包括酶標記物的制備及滴配過程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標反應板、分裝及包裝等步驟;并通過產(chǎn)品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質(zhì)控過程來保證其質(zhì)量符合規(guī)定。

1.各種工作液的配制

酶聯(lián)免疫診斷試劑研制生產(chǎn)過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標準品（或校準品）溶液。若陰性、陽性對照或其他液體組分涉及生物安全性問題，制備時應在相應的生物安全實驗室完成。

各種工作液在配制過程中應嚴格按質(zhì)量標準中的配方進行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時進行相應的質(zhì)量檢驗并達到質(zhì)量標準后，方可使用或分裝。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應具有量值溯源性。

應對配制過程及配制的液體進行的質(zhì)量控制，主要包括酶結合物的功能性實驗及穩(wěn)定性;各種溶液的外觀、pH值等;酶作用底物應測定在無相應酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標;終止液應對其終止酶促反應的能力進行測定。

2.包被酶標反應板

包被前應對酶標反應板進行質(zhì)量檢驗，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標反應板的批號、數(shù)量、標識。酶標反應板經(jīng)檢驗合格后方能用于包被。不同批號的板條不能混用。

選擇經(jīng)檢驗合格的包被原料（如抗原、抗體等），經(jīng)一定的方法確定最佳包被濃度和酶結合物工作濃度，按照診斷試劑的生產(chǎn)規(guī)程，配制包被緩沖液、封閉液，經(jīng)檢驗合格后，包被酶標反應板，經(jīng)干燥后，已包被的酶標反應板用鋁箔紙封閉（內(nèi)置干燥劑），保存于2~8℃。

應對包被過程進行相應的質(zhì)量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質(zhì)量檢驗、包被液和封閉液的質(zhì)控（如配方、外觀、pH值）、包被過程的監(jiān)控（包括包被和封閉的體積、溫度、時間等）、包被均一性檢驗、干燥過程的監(jiān)控等。

3.分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應嚴格按照質(zhì)量標準中的量進行過濾后再分裝，分裝量的誤差應小于5%。

分裝及包裝均應按照相應的標準操作規(guī)程要求進行。包裝前，應嚴格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數(shù)量，并在關盒前進行復核。

（四）質(zhì)量控制

1.半成品質(zhì)量控制

（1）半成品抽樣

檢驗人員按試劑的批號，根據(jù)抽樣申請單抽取規(guī)定數(shù)量的半成品各組分，作號標記、待檢。

（2）半成品檢驗

根據(jù)試劑盒的企業(yè)標準或者制檢規(guī)程進行半成品的檢驗。

半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經(jīng)國家標準品（參考品）標化后的企業(yè)參考品。若某類試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

檢驗指標一般包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應達到相應的質(zhì)量標準要求。對于精密性，一般情況下CV不得高于15%（采用競爭抑制法的診斷試劑CV不得高于20%）。對定量檢測試劑，同時應分析其線性相關系數(shù)和定量質(zhì)控品檢測結果的準確性。

企業(yè)應該對每一批試劑的半成品進行穩(wěn)定性研究。試劑盒各組分應留樣，2~8℃定期作穩(wěn)定性考核，同時作37℃熱穩(wěn)定性試驗，試驗結果應符合產(chǎn)品的質(zhì)量標準。

2.成品質(zhì)量控制

產(chǎn)品包裝完成后，質(zhì)檢人員根據(jù)試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進行抽樣，同時填寫抽樣數(shù)量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數(shù)量應包括檢驗用數(shù)量和留樣數(shù)量。質(zhì)檢人員同時應檢查相關原始記錄。

每一批酶聯(lián)免疫類檢測試劑的試生產(chǎn)量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩(wěn)定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。

（1）成品檢驗

成品檢驗時，一般使用國家標準品（參考品）或經(jīng)國家標準品（參考品）標化后的企業(yè)參考品，并達到相應質(zhì)量要求。若該診斷試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

（2）穩(wěn)定性試驗

在批放行前，每一批試劑應完成37℃熱穩(wěn)定性試驗，試驗結果應符合產(chǎn)品的質(zhì)量標準。

四、名詞解釋

酶聯(lián)免疫法：是指在酶標板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測樣品中的相關抗體（和/或抗原）反應，形成的抗原抗體復合物再與相應的酶標記的抗體和/或抗原進一步反應，經(jīng)過酶催化底物發(fā)生顯色反應，由形成的顏色的強弱來判斷樣本中相應的抗體和/或抗原的存在。

五、參考文獻：

1.《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），化學工業(yè)出版社