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HLA-B27基因檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則（征求意見稿）

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對人類白細胞抗原B27（HLA-B27）基因檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門提供參考。

本指導(dǎo)原則是對HLA-B27基因檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導(dǎo)原則為注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

強直性脊柱炎是一種慢性炎性疾病，本病常發(fā)于青壯年男性，主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)、脊柱骨突、脊柱旁軟組織和外周關(guān)節(jié)，可伴發(fā)前葡萄膜炎等關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，嚴(yán)重者發(fā)生脊柱畸形和強直。

HLA-B27基因位于人類第6號染色體短臂HLA基因B座，具有高度基因多態(tài)性，其表達產(chǎn)物為HLA-B27抗原。HLA-B27 抗原表達與強直性脊柱炎高度相關(guān)，超過90%的強直性脊柱炎患者的HLA?B27 抗原表達為陽性，而普通人群中僅5% ~10% 為陽性。HLA-B27在其他脊柱關(guān)節(jié)炎疾病中也有不同的檢出，在反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎中陽性率可達60%-90%，在銀屑病關(guān)節(jié)炎和炎性腸病關(guān)節(jié)炎中陽性率均可達50%-60%。

HLA-B27約有167個基因亞型，各亞型分布存在地域和人種差異。HLA-B*2705是全球分布最廣的亞型，被認為是其他基因亞型的祖基因。在中國漢族人群中，HLA-B*2704和HLA-B*2705是主要優(yōu)勢亞型，同時還存在HLA-B*2702、HLA-B*2703、HLA-B*2706、HLA-B*2707、HLA-B*2709。HLA-B*2702、HLA-B*2704、HLA-B*2705和HLA-B*2707是疾病易感基因，而HLA-B*2703、HLA-B*2706和HLA-B*2709與疾病的關(guān)系尚存在爭議。

本指導(dǎo)原則適用于基于熒光PCR法，定性檢測人靜脈全血樣本中的HLA-B27基因的試劑，用于強直性脊柱炎的輔助診斷。

對于采用其他分子生物學(xué)檢測方法（如基因測序法）或其他樣本類型的檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面；申請人可參考本指導(dǎo)原則，同時依據(jù)產(chǎn)品特性對適用部分進行評價，對不適用部分闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學(xué)合理性。

本指導(dǎo)原則針對相關(guān)產(chǎn)品注冊申報資料中的部分內(nèi)容進行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊審查要點

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，同時建議申請人參考已上市同類產(chǎn)品的產(chǎn)品名稱。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表（應(yīng)包含醫(yī)療器械唯一標(biāo)識）、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。其中,產(chǎn)品描述應(yīng)詳述技術(shù)原理、產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價、與同類和/或前代產(chǎn)品的比較等。與同類和/或前代產(chǎn)品的比較應(yīng)著重從預(yù)期用途、技術(shù)原理、主要組成成分、性能指標(biāo)、臨床應(yīng)用情況等方面詳細說明申報產(chǎn)品與已獲批準(zhǔn)的同類/前代產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。

（三）非臨床資料

1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

注冊申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價等結(jié)果，依據(jù)相關(guān)文件資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。

第三類體外診斷試劑應(yīng)當(dāng)提供三個不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品的檢驗報告。目前已有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)布，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)要求?？商峤灰韵氯我恍问降臋z驗報告：

（1）申請人出具的自檢報告。

（2）委托有資質(zhì)的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)出具的檢驗報告。

如有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

2.分析性能研究

注冊申請人應(yīng)提交在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進行的所有分析性能評估資料，包括具體試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析結(jié)果及結(jié)論等詳細資料。有關(guān)試驗的背景信息也應(yīng)在申報資料中進行描述，包括試驗地點，采用的試劑名稱、規(guī)格和批號，儀器名稱和型號，樣本的背景信息（來源、樣本編號、樣本類型、采集及處理方式、基因型和濃度確認方法及結(jié)果）等。分析性能評估用樣本應(yīng)為真實樣本，如聲稱多種適用樣本類型，注冊申請人應(yīng)針對不同樣本類型分別完成性能評估研究。

分析性能評估的試驗方法可以參考國際或國內(nèi)有關(guān)體外診斷試劑性能評估的指導(dǎo)原則進行，對于本類產(chǎn)品建議著重對以下分析性能進行研究。

2.1樣本穩(wěn)定性及適用的樣本類型

應(yīng)充分考慮樣本采集/處理、運輸、保存等各環(huán)節(jié)的影響，確定樣本的保存條件及保存時間并對樣本穩(wěn)定性進行充分驗證。如樣本提取后不立即進行檢測，則還需對提取后的DNA穩(wěn)定性進行充分研究。如聲稱多種適用樣本類型，注冊申請人應(yīng)針對不同樣本類型分別進行樣本穩(wěn)定性研究。

對于全血樣本，如適用多種抗凝劑，建議通過同源比對研究對一定數(shù)量的臨床樣本驗證各種抗凝劑的適用性。

2.2質(zhì)控品的賦值

描述質(zhì)控品的賦值過程，并提交三批產(chǎn)品在不同適用機型上的賦值研究資料。

2.3準(zhǔn)確度

可通過申報產(chǎn)品與測序結(jié)果或已上市同類產(chǎn)品進行方法學(xué)比對研究，評價申報產(chǎn)品的準(zhǔn)確度；也可通過檢測參考品（盤）分析申報產(chǎn)品檢測結(jié)果與經(jīng)確認結(jié)果的符合情況，評價申報產(chǎn)品的準(zhǔn)確度。

評價準(zhǔn)確度的樣本應(yīng)由若干份臨床樣本組成，樣本類型應(yīng)與產(chǎn)品適用范圍一致，包含不同濃度水平。

2.4精密度

包括重復(fù)性、中間精密度和再現(xiàn)性。

精密度評價應(yīng)采用真實樣本進行研究，納入陰性樣本、弱陽（檢出限附近）樣本和強陽樣本。試驗操作應(yīng)按照說明書執(zhí)行，需包含核酸提取/純化等樣本處理步驟。

精密度評價需滿足如下要求：

2.4.1對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑（包括核酸提取/純化組分）本身外，還包括儀器、操作者、地點、時間、檢測輪次、試劑批次等。

2.4.2設(shè)定合理的精密度評價周期，并對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間、不同操作者間和不同實驗室間的精密度進行綜合評價。

2.4.3可結(jié)合產(chǎn)品的特點，對精密度指標(biāo)評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如CV值。

2.5最低檢出限和檢測上限

2.5.1最低檢出限和檢測上限的建立

最低檢出限為在滿足檢測準(zhǔn)確性和精密度的條件下，能夠檢出目標(biāo)基因的人基因組DNA最低濃度。
       可采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進行多次重復(fù)檢測，確定95%檢出率水平下的人基因組DNA最低濃度，即為最低檢出限。系列稀釋度應(yīng)能夠覆蓋大部分檢出概率區(qū)間（0～100%），可根據(jù)各濃度梯度檢測結(jié)果直接判定，也可通過適當(dāng)?shù)哪Ｐ停ㄈ鏟robit分析）和其他分析方法計算申報產(chǎn)品在設(shè)定概率下的檢出限，一般在該檢測濃度下應(yīng)具有95%的檢出率。

同時，申請人亦應(yīng)評價可準(zhǔn)確檢出的人基因組DNA濃度上限，即適當(dāng)檢出率水平下的人基因組DNA最高濃度。

應(yīng)采用臨床樣本進行檢出限及檢測上限研究。

2.5.2最低檢出限和檢測上限的驗證

選取與建立不同的臨床樣本進行驗證，建議對最低檢出限和檢測上限附近濃度水平的樣本進行至少20次的重復(fù)檢測，應(yīng)滿足95%以上檢出率要求。

2.6 分析特異性

2.6.1干擾試驗

可通過在臨床樣本中添加干擾物質(zhì)的方式，評價添加前后干擾物質(zhì)對靶基因檢測的影響。研究用樣本應(yīng)包含陰性樣本、弱陽性樣本和中陽性樣本（正常白細胞濃度水平樣本）。

建議注冊申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價，如有干擾，應(yīng)確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

應(yīng)針對可能的內(nèi)源和外源性干擾物進行干擾試驗研究。對于全血樣本，內(nèi)源性干擾物質(zhì)應(yīng)包括血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、白蛋白、；外源性干擾物質(zhì)應(yīng)包括抗凝劑、乙醇、乙醛、預(yù)期人群常用治療藥物等如消炎痛、潑尼松、吡羅昔康、美洛昔康、 塞來昔布、 雙氯芬酸鈉、 吲哚美辛、 萘丁美酮、 布洛芬、 萘普生、柳氮磺胺吡啶等。

同時納入有代表性的患者樣本，通過對申報產(chǎn)品與不受該干擾物影響的測量方法檢測結(jié)果進行對比，進行干擾物質(zhì)研究。

2.6.2交叉反應(yīng)

應(yīng)對與靶基因序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的其他HLA基因的基因序列進行交叉反應(yīng)研究。

對于全血樣本，需提供血源性感染常見的病原體（如：乙肝、丙肝、HIV、梅毒）的交叉反應(yīng)研究。

2.7 其他性能研究

2.7.1如申報產(chǎn)品的檢測靶標(biāo)為具體基因亞型且不能分型，分析性能研究中應(yīng)對申報產(chǎn)品聲稱的每種基因亞型進行研究和驗證。

2.7.2包容性研究

如申報產(chǎn)品的檢測靶標(biāo)為HLA-B27基因，應(yīng)證明申報試劑具有檢出不同HLA-B27亞型的能力。應(yīng)至少包括中國人群已知常見亞型B2702、B2704、B2705、B2707等。

包容性研究應(yīng)分別對上述常見亞型進行精密度（重復(fù)性、中間精密度和再現(xiàn)性精密度）研究和最低檢出限的驗證。

2.8核酸提取/純化性能

在進行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進行平行比對。

若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行精密度、檢出限和抗干擾的驗證。

2.9反應(yīng)體系研究

2.9.1樣本采集和處理

請詳述樣本的采集及處理方式，明確樣本的保存介質(zhì)。

2.9.2反應(yīng)體系

應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性，提供反應(yīng)體系的確定研究資料。包括但不限于核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR反應(yīng)中樣本和試劑的加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)條件（如：溫度、時間、循環(huán)數(shù)）等。

如有多個適用機型，需提供不同適用機型基線和閾值的確定資料。不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

3.穩(wěn)定性研究

申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、結(jié)果以及結(jié)論。

3.1實時穩(wěn)定性研究

提交至少三批申報產(chǎn)品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。明確儲存的環(huán)境條件（如溫度、濕度和光照）及有效期。

3.2使用穩(wěn)定性

提交申報產(chǎn)品實際使用期間穩(wěn)定性的研究資料，應(yīng)包括所有組成成分的開封穩(wěn)定性。適用時提交復(fù)溶穩(wěn)定性、機載穩(wěn)定性及凍融次數(shù)研究資料等。明確產(chǎn)品使用的溫度、濕度條件等。

3.3運輸穩(wěn)定性

以文字結(jié)合圖示的方式詳細描述運輸包裝，明確產(chǎn)品實際運輸?shù)沫h(huán)境條件（如溫度、濕度、光照和機械保護等）及暴露的最差運輸條件。提交申報產(chǎn)品可在特定或者預(yù)期的條件下運輸?shù)难芯抠Y料。

4.陽性判斷值研究

陽性判斷值即為能夠獲得理想的檢測準(zhǔn)確性的臨界值（Cut-off）。研究樣本應(yīng)為預(yù)期使用人群的真實樣本，涵蓋中國人群常見HLA-B27亞型。樣本來源應(yīng)具有地域和民族多樣性，考慮不同時間和生理/病理狀。

采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進行研究，亦可采用其他科學(xué)合理的方法進行陽性判斷值研究。

申請人應(yīng)詳述試驗方案，列明所用試劑、儀器、對比方法、樣本量、樣本入組標(biāo)準(zhǔn)；提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括民族、性別、年齡、來源、唯一可溯源編號、臨床診斷信息等）及試驗結(jié)果等。

如果試劑判讀存在灰區(qū)，應(yīng)解釋說明灰區(qū)范圍的確定方法。

提供內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

5.其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇、來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供詳細的制備過程及支持性資料；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

5.1.1引物和探針

應(yīng)詳述引物、探針的設(shè)計原則，提供引物探針序列、靶基因序列及兩者的對應(yīng)情況。建議設(shè)計兩套或多套引物探針以供篩選，針對待測位點的檢測靈敏度和特異性等進行評價，選擇最佳引物探針組合，并提交詳細的篩選研究數(shù)據(jù)。同時應(yīng)針對引物、探針及檢測靶序列與公開數(shù)據(jù)庫進行同源性分析，如有同源序列應(yīng)著重評價是否會有交叉反應(yīng)。

申請人應(yīng)針對選定的引物、探針原材料進行質(zhì)量評價，一般包括：外觀、分子量、純度、濃度、探針熒光標(biāo)記基團的激發(fā)波長和發(fā)射波長，以及功能性試驗等，并依據(jù)評價結(jié)果建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應(yīng)提交對其純度、濃度、保存穩(wěn)定性以及功能性試驗等資料，并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

5.1.3酶

可能涉及到的酶包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、熱穩(wěn)定性、功能性試驗等進行評價和驗證，并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

DNA聚合酶應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應(yīng)具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

5.1.4質(zhì)控品

選擇檢測范圍內(nèi)一種或多種亞型制備陽性質(zhì)控品，同時設(shè)置不含待測靶序列的空白質(zhì)控品用于交叉污染的質(zhì)控。

HLA-B基因存在個體差異，并非所有人體均具有HLA-B27，因此試劑盒中需另外設(shè)置內(nèi)標(biāo)對照。

質(zhì)控體系應(yīng)能夠?qū)z測全過程進行有效的質(zhì)量控制，包括試劑及儀器性能、可能的擴增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染等因素造成的假陰性或假陽性結(jié)果。質(zhì)控品可采用臨床樣本核酸提取液或細胞系等?？瞻踪|(zhì)控品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。申請人應(yīng)針對質(zhì)控品原料來源、選擇、制備、定值過程等提供詳細的研究資料，并對質(zhì)控品的檢測結(jié)果做出明確的范圍要求。

5.1.5  內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對照，可對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴增。申請人需對內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進行監(jiān)控。

5.1.6核酸提取/純化試劑（如有）

應(yīng)提供試劑的主要組成、原理介紹及相關(guān)的篩選及驗證資料。

5.1.7企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。企業(yè)參考品應(yīng)為真實樣本，且應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點和性能驗證的實際需要進行設(shè)置。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、濃度及基因亞型確認方法或試劑等相關(guān)研究資料。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽性參考品應(yīng)包含可檢出的各HLA-B27亞型，且應(yīng)設(shè)置不同濃度水平。

陰性參考品應(yīng)考慮檢測特異性的評價，納入同源序列交叉反應(yīng)樣本、干擾樣本、HLA-B27陰性樣本等。

檢出限參考品的設(shè)置與陽性參考品相同，濃度水平應(yīng)包括最低檢出限濃度或略高于最低檢出限濃度。

精密度參考品至少包括HLA-B2704和HLA-B2705；每個亞型包括高、低兩個濃度水平，其中一個濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

該類產(chǎn)品生產(chǎn)工藝研究資料主要包括工作液配制（引物探針濃度、酶濃度、dNTP濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干、熒光標(biāo)記等工藝過程的描述及確定依據(jù)。

生產(chǎn)過程應(yīng)對關(guān)鍵參數(shù)進行有效控制，可結(jié)合工藝流程圖描述生產(chǎn)工藝過程，明確關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細說明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。并提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評價資料

臨床試驗的開展、方案的制定以及報告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》（國家藥品監(jiān)督管理局通告2021年第72號）的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗應(yīng)符合更新后的要求。

1.臨床試驗機構(gòu)

應(yīng)選擇至少3家（含3家）已備案的臨床試驗機構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)的要求開展臨床試驗。申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點及預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學(xué)背景等因素選擇臨床試驗機構(gòu)。臨床試驗機構(gòu)應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉臨床試驗方案。

2.臨床試驗方法

如申報產(chǎn)品已有同類產(chǎn)品上市，建議申請人選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市的同類產(chǎn)品作為對比試劑/方法，采用申報產(chǎn)品與之進行對比試驗研究，評價申報產(chǎn)品的臨床性能。對比試劑的選擇應(yīng)從預(yù)期用途、樣本要求、檢測性能等方面，確認其與申報產(chǎn)品具有較好的可比性。如對比試劑不可分型，還應(yīng)選擇臨床參考方法（如：一代測序）對臨床試驗中的陽性樣本進行分型，確認申報產(chǎn)品所聲稱的基因亞型均被驗證。

3.受試者選擇和樣本類型

3.1受試者選擇

受試者應(yīng)為強直性脊柱炎疑似患者，應(yīng)具有相關(guān)疑似癥狀或體征等，如：炎性腰背痛、外周關(guān)節(jié)炎和足趾炎等；臨床試驗還應(yīng)納入部分需要鑒別診斷的其他患者，如：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者等癥狀相似人群。

3.2 樣本類型

適用的樣本類型一般為靜脈全血。臨床試驗應(yīng)納入臨床原始樣本，不應(yīng)直接采用提取的基因組DNA進行試驗。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)同時滿足申報產(chǎn)品說明書以及對比試劑說明書（如適用）的相關(guān)要求。

4.臨床試驗樣本量

臨床試驗樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法進行估算，同時應(yīng)滿足法規(guī)最低樣本量的要求。

建議采用單組目標(biāo)值法進行樣本量估算。陽性符合率和陰性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議均不低于95%。當(dāng)評價指標(biāo)PT接近100%時，該樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進行樣本量估算和統(tǒng)計學(xué)分析，如精確概率法等。

上述公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分數(shù)位，P0為評價指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為申報產(chǎn)品評價指標(biāo)預(yù)期值。

臨床試驗總體樣本量確定時應(yīng)在上述陽、陰性樣本最低樣本量估算的基礎(chǔ)上，同時考慮其他可能造成受試者脫落的情況以及可能需要納入的干擾樣本、交叉反應(yīng)樣本等情況適當(dāng)增加入組樣本量.

如申報產(chǎn)品的檢測靶標(biāo)為具體基因亞型且不能分型，臨床試驗應(yīng)對申報產(chǎn)品聲稱的每種基因亞型進行驗證，每種基因亞型均應(yīng)有一定的陽性例數(shù)。

如申報產(chǎn)品的檢測靶標(biāo)為HLA-B27基因，臨床試驗至少應(yīng)對常見基因亞型進行驗證，至少應(yīng)驗證HLA-2704、HLA-2705、HLA-2702和HLA-2707等,每種基因亞型均應(yīng)具有一定的陽性例數(shù)。

 5.統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)對入組人群進行人口學(xué)分析，包括年齡、性別和臨床診斷背景信息等。應(yīng)總結(jié)各基因亞型的例數(shù)，以2×2表分別總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，并分別計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率及其95%置信區(qū)間。對于可分型的試劑，應(yīng)以2×2表分別總結(jié)兩種試劑不同基因亞型的定性檢測結(jié)果，并分別計算不同基因亞型的符合率和總符合率及其95%置信區(qū)間。

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用合理方法進行復(fù)核，并對差異原因進行分析。如無需復(fù)核，應(yīng)說明理由。

6.倫理學(xué)要求

臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則。研究者應(yīng)考慮臨床試驗用樣本的獲得和試驗結(jié)果對受試者的風(fēng)險，提請倫理委員會審查，并獲得倫理委員會的同意。注冊申報時應(yīng)提交倫理委員會的審查意見。

7.臨床試驗方案

各臨床試驗機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床試驗機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實驗進程。

試驗方案應(yīng)確定嚴(yán)格的入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程和結(jié)果判定時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各臨床試驗機構(gòu)選用的對比試劑/方法應(yīng)保持一致，以便進行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。

8.質(zhì)量控制

臨床試驗開始前，建議進行臨床試驗的預(yù)試驗，以熟悉并掌握相關(guān)試驗方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗誤差。整個試驗過程都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及精密度。

9.臨床試驗報告撰寫

臨床試驗報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法，最后得出臨床試驗結(jié)論。臨床試驗報告的撰寫參考《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。

（五）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說明書的技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標(biāo)注，并單獨注明文獻的相關(guān)信息。

以下內(nèi)容僅對HLA-B27基因檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細說明，說明書其他內(nèi)容應(yīng)根據(jù)《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》要求進行編寫。

1.【預(yù)期用途】 應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測人體靜脈外周血樣本中的HLA-B27基因。

1.2介紹被測基因與臨床適用癥的關(guān)系，明確HLA-B27在中國人群中的分布頻率，在臨床適用癥人群中的發(fā)生頻率。

1.3明確本產(chǎn)品檢測結(jié)果僅供臨床參考，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、療效及其他實驗室檢測指標(biāo)等對本產(chǎn)品的檢測結(jié)果進行綜合判斷。

2.【檢驗原理】

2.1對被測靶基因在HLA-B基因中的區(qū)域位置，片段大小、保守與否等進行詳細描述，對試劑盒所用探針、引物、陽性結(jié)果的判定方式等進行詳細的介紹；明確內(nèi)標(biāo)基因的名稱及其作用。對不同樣本反應(yīng)管組合、質(zhì)控品設(shè)置及熒光信號檢測原理等進行介紹。

2.2如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對其作用機理進行簡要介紹。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分的名稱、數(shù)量和裝量。

明確各組分中的引物、探針、酶、dNTP、緩沖液名稱、防腐劑名稱。

明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產(chǎn)品名稱、注冊人，貨號及注冊證號。

明確不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

4.【檢驗方法】

詳細說明試驗操作的各個步驟，包括：

4.1試驗條件：必要時，應(yīng)明確實驗室分區(qū)、試驗環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項。

4.2試劑配制方法和注意事項。

4.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項，列明全血樣本用量、洗脫體積等；對核酸提取純化環(huán)節(jié)進行合理的質(zhì)量控制，明確提取核酸的濃度純度等質(zhì)量要求。

4.4擴增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

4.5 PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動化檢測程序及相關(guān)注意事項。

4.6儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、探針的熒光素標(biāo)記情況、各熒光通道選擇等。

5.【陽性判斷值】

明確靶基因和內(nèi)標(biāo)基因的陽性判斷值，簡要說明建立和驗證陽性判斷值的基本信息，包括樣本量、人群特征（民族、性別、年齡、生理/病理狀態(tài)等）和采用的統(tǒng)計學(xué)方法。

6.【檢驗結(jié)果的解釋】

以列表形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應(yīng)的解釋。

7.【檢驗方法的局限性】

7.1列明可檢測的HLA-B27亞型，明確其他亞型未進行驗證。

7.2明確可能出現(xiàn)的交叉反應(yīng)。列明可檢出的同源序列、其他HLA基因等。

7.3有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析。

7.3.1不合理的樣本采集、運送及處理或核酸過度降解均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

7.3.2未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。

7.4 明確是否可區(qū)分HLA-B27雜合或純合。

7.5明確正常人群中也可表達HLA-B27，臨床使用中應(yīng)結(jié)合檢測結(jié)果、其他癥狀/體征、病史、實驗室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

8.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

8.1符合國家標(biāo)準(zhǔn)品的情況。

8.2準(zhǔn)確度研究方案和結(jié)果。

8.3精密度研究的總結(jié)，包括實驗方案、樣本量、各樣濃度水平、不精密度考慮因素（時間、地點和人員等）。

8.4最低檢出限。明確可檢出DNA濃度水平范圍。

8.5干擾研究結(jié)果。明確各內(nèi)源和外源性干擾物對檢測結(jié)果不產(chǎn)生影響的最高濃度。

8.6交叉反應(yīng)研究結(jié)果。明確納入研究的同源序列/HLA基因是否存在交叉反應(yīng)。

8.7 包容性研究總結(jié)。明確可檢出的亞型。

8.8臨床試驗總結(jié)。

9.【注意事項】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

9.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

9.2臨床實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

（六）質(zhì)量管理體系文件

申請人應(yīng)當(dāng)在申請注冊時提交與產(chǎn)品研制、生產(chǎn)有關(guān)的質(zhì)量管理體系相關(guān)資料。詳述產(chǎn)品的生產(chǎn)過程，提供生產(chǎn)工藝流程圖。明確申報產(chǎn)品反應(yīng)及檢測原理和過程，標(biāo)明主要控制點與項目及主要原材料、采購件的來源及質(zhì)量控制方法。

如適用，應(yīng)當(dāng)提供擬核查產(chǎn)品與既往已通過核查產(chǎn)品在生產(chǎn)條件、生產(chǎn)工藝等方面的對比說明。