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核酸擴增法檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則
（食藥監(jiān)辦械函[2013]3號）

一、前言

本指導(dǎo)原則主要針對核酸擴增類檢測試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)提出指導(dǎo)性技術(shù)要求。

本指導(dǎo)原則系對核酸擴增法檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善、科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其相關(guān)內(nèi)容也將進行適時的調(diào)整。

二、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于核酸擴增法檢測試劑的注冊技術(shù)審查，其他類核酸檢測試劑可參照相關(guān)內(nèi)容。

三、基本要求

（一）基本原則

1.核酸擴增類檢測試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》。研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標準，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。

2.試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具有與其技術(shù)要求相適應(yīng)的人員、廠房、設(shè)施和儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，配備滿足核酸提取和擴增檢測以及操作人員防護所需的設(shè)備。建立專用實驗室，實驗室應(yīng)當嚴格分區(qū)，人員和物品應(yīng)當單向流動，以最大限度地防止實驗過程中樣品之間的污染和避免擴增產(chǎn)物的污染。生產(chǎn)用于病原微生物核酸檢測的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立符合生物安全要求的設(shè)施和措施。

3.試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實施細則（試行）》的要求，建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，并應(yīng)通過《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。

4.核酸擴增類檢測試劑的引物設(shè)計應(yīng)當符合核酸檢測設(shè)計的要求，擴增體系應(yīng)設(shè)定合理的內(nèi)標和外標，試劑需設(shè)置抗污染的特定措施，擴增產(chǎn)物須進行確證研究。

5.企業(yè)使用新型原材料時，應(yīng)提供與通行原材料比對研究結(jié)果及相關(guān)資料。使用未列入上述標準的化學(xué)試劑，應(yīng)不低于分析純。

（二）原材料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品或標準品等的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)量標準等的相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定;如主要原材料來自市場（從其他單位購買），應(yīng)提供的資料包括：對物料供應(yīng)商審核的相關(guān)資料、購買合同、供貨方提供的質(zhì)量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。主要原材料（包括生產(chǎn)工藝）或其供應(yīng)商發(fā)生變更，應(yīng)依據(jù)國家相關(guān)法規(guī)的要求進行變更申請。

核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

1.脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。應(yīng)為高效液相色譜（HPLC）純、PCR級，無DNase和RNase污染?！?0℃保存。

2.引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用脫氧核糖核酸（DNA）合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。

凍干粉，序列正確，合成量應(yīng)達到試劑生產(chǎn)要求。純度應(yīng)達到電泳級（PAGE）或HPLC級，不含雜帶。應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。

應(yīng)作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度計測定OD_260nm/OD_280nm的比值在1.6—2.0之間，可視為合格引物。-20℃保存。

3.探針

是指特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5'-端（和/或3'-端）進行標記，如熒光素報告基團或其他發(fā)光標記物，在3'-端標記熒光素淬滅基團，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化。

凍干粉，純度應(yīng)達到HPLC純。應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜;應(yīng)對探針的核酸序列及標記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物進行核實，并作HPLC分析。應(yīng)以可見—紫外分光光度計進行200—800nm掃描，在260nm處應(yīng)有吸收峰。另外，根據(jù)標記熒光素的不同，還應(yīng)該在熒光素的激發(fā)波長處有吸收峰，如FAM熒光素在494nm、TET熒光素在521nm、TAMRA熒光素在560nm處有特異的吸收峰，雜交探針在493nm、625nm、685nm處有特異的吸收峰，檢定合格后入庫。避光、-20℃保存。

4.DNA聚合酶

如Taq DNA聚合酶。應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性;具熱穩(wěn)定性，94℃保溫1小時后仍保持50%活性。-20℃保存。

5.尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，IU UNG在 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模板應(yīng)完全降解，不能產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。-20℃保存。

6.逆轉(zhuǎn)錄酶

具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性。—20℃保存。

（三）生產(chǎn)工藝

核酸擴增類檢測試劑的基本生產(chǎn)工藝通常包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進行有效控制。

工藝研究的資料應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、校準方法、質(zhì)控方法、臨界值的確定、穩(wěn)定性和有效期，提供確切的依據(jù)。

（四）質(zhì)量控制

1.半成品質(zhì)量控制

（1）按批號抽取規(guī)定數(shù)量的半成品。

（2）以參考品/對照品進行半成品質(zhì)量控制。如果產(chǎn)品具有國家標準品或參考品，應(yīng)以其進行檢定。如果產(chǎn)品不具有國家標準品或參考品，應(yīng)根據(jù)規(guī)定制備相應(yīng)的企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

（3）半成品檢定內(nèi)容包括：陰/陽性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度。檢測結(jié)果應(yīng)符合質(zhì)量標準的要求。

（4）半成品檢定合格后，按試劑盒組成及時進行分裝和包裝。

2.成品質(zhì)量控制

（1）每一批核酸擴增法檢測試劑的試生產(chǎn)量應(yīng)滿足工藝研究、分析性能驗證、穩(wěn)定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。

（2）產(chǎn)品完成包裝后，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)量進行抽樣和生產(chǎn)記錄審核。

（3）以參考品/對照品進行成品質(zhì)量檢驗。結(jié)果應(yīng)符合要求。

（4）成品檢驗的內(nèi)容應(yīng)包括：陰/陽性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度、線性范圍（定量產(chǎn)品）和穩(wěn)定性。

5.試劑批放行前，應(yīng)對需要進行穩(wěn)定性考核的試劑成分，在特定溫度或條件下進行穩(wěn)定性試驗。穩(wěn)定性試驗可采用加速破壞試驗。

四、名詞解釋

核酸擴增法檢測試劑：核酸擴增技術(shù)泛指以擴增脫氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）為手段，檢測特定核酸序列或篩查特定基因的檢測技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、連接酶鏈反應(yīng)（LCR）、轉(zhuǎn)錄依賴的擴增反應(yīng)（TMA）等。核酸擴增法檢測試劑是基于核酸擴增檢測技術(shù)的體外診斷試劑，目前已經(jīng)用于病原體檢測、特定疾病的早期診斷和體內(nèi)物質(zhì)的型別鑒定等不同領(lǐng)域。

五、參考文獻

1.《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社