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乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則
（2013年第3號）

一、前言

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid, DNA）定量檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）定量檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。如申請人認為有必要增加本指導(dǎo)原則不包含的研究內(nèi)容，可自行補充。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當(dāng)前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

二、適用范圍

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，我國屬乙型肝炎感染地方性流行區(qū)。根據(jù)2006年全國乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查，我國的慢性HBV感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例，每年因乙型肝炎導(dǎo)致的肝硬化和肝癌死亡約30余萬例，新發(fā)乙型肝炎病例約50萬～100萬例，乙肝防治是當(dāng)前及今后相當(dāng)長時間內(nèi)要面臨的重要任務(wù)。

乙型肝炎是血源傳播性疾病，主要經(jīng)血（如不安全注射等）、母嬰及性接觸傳播。HBV屬嗜肝脫氧核糖核酸（DNA）病毒科（hepadnaviridae），基因組長約3.2 kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。急性HBV感染DNA存在先陽性后消失的發(fā)展過程，慢性HBV感染的自然史一般可分為4個期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動或低（非）復(fù)制期和再活動期，其中免疫耐受期HBV DNA滴度較高（大于20 000 IU/ml），免疫清除期表現(xiàn)為血清HBV DNA滴度大于2000 IU/ml，但一般低于免疫耐受期。非活動或低（非）復(fù)制期滴度較低（小于2000 IU/ml），部分再活動期患者表現(xiàn)為HBV DNA活動性復(fù)制，但并不是所有HBV感染者都經(jīng)歷以上四期。

HBV已發(fā)現(xiàn)有9個基因型（A～I），每個基因型又可分為不同亞型，且存在基因型之間的重組現(xiàn)象。我國已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D基因型，中東部地區(qū)以B、C基因型占優(yōu)勢，其中北方地區(qū)（長江以北）主要為C2亞型;南方大部分地區(qū)流行株為B2、C2、C1亞型，并有少部分D基因型;西部地區(qū)尤其是新疆地區(qū)以D基因型為主，西部藏族居民中以C/D重組基因型為主;A型和B1亞型罕見。

HBV DNA定量檢測試劑是指利用包括實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）或其他的分子生物學(xué)方法在內(nèi)的核酸檢測技術(shù)，以HBV基因序列為檢測靶標，對人血清、血漿及其他人體樣本中的HBV DNA進行體外定量檢測的試劑。結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他實驗室指標，可作為乙型肝炎輔助診斷的指標之一，還可通過對血液中HBV DNA濃度的檢測可用于HBV感染的輔助診斷、治療適應(yīng)癥的選擇及抗病毒療效的判斷。

本指導(dǎo)原則適用于實時熒光PCR方法的HBV DNA定量檢測試劑，其他類同用途的核酸定量檢測方法可參照本指導(dǎo)原則，但應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性確定其中具體內(nèi)容是否適用，如不適用，應(yīng)另行選擇符合自身方法學(xué)特性的技術(shù)要求或評價方法。本指導(dǎo)原則適用于進行首次注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。

本指導(dǎo)原則不適用于國家法定血源篩查用HBV DNA檢測試劑。

三、基本要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)及檢出限等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監(jiān)械〔2007〕229號）和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監(jiān)械〔2007〕609號）的相關(guān)要求。

（二）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、試驗原理、試驗方法、檢測結(jié)果解釋以及注意事項等重要信息，是指導(dǎo)實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)。因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號）的要求，境外產(chǎn)品的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標注，并單獨列明參考文獻的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號）的要求，下面對HBV DNA定量檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細說明，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地制定產(chǎn)品說明書。

1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

（1）試劑盒用于定量檢測人血清、血漿等樣本中的HBV DNA，適用樣本類型應(yīng)依據(jù)申報產(chǎn)品的分析性能評估和臨床研究情況進行確認。

（2）待測人群特征介紹：主要為接受抗病毒治療的乙型肝炎患者。

（3）臨床用途：主要通過對乙型肝炎患者血中HBV DNA基線水平和變化情況的監(jiān)測，用于評估抗病毒治療的應(yīng)答和治療效果監(jiān)測。

如有其他用途（如隱匿性感染的輔助診斷）則應(yīng)對產(chǎn)品適應(yīng)癥人群、預(yù)期用途另行說明，并提供與之相應(yīng)的分析性能評估以及臨床驗證等資料。本指導(dǎo)原則內(nèi)容僅針對治療監(jiān)測用途進行要求。

（4）應(yīng)當(dāng)說明該試劑檢測結(jié)果不得作為患者病情評價的唯一指標，必須結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。

（5）明確說明該檢測試劑不得用于血源篩查。

2.【主要組成成分】

（1）說明試劑盒所包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，如定量標準品、陰/陽性質(zhì)控品含有人源組分，應(yīng)提供其生物學(xué)來源、活性及其他特性;說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

（2） 試劑盒中不包含但該項檢測必需的組分，說明書中應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、注冊證號（如有）及其他相關(guān)信息。

（3）如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、注冊證號（如有）以及配套儀器等詳細信息。

3.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)標明具體的儲存條件及效期。

4.【樣本要求】

（1）樣本收集要求：結(jié)合臨床需要并參照慢性乙型肝炎防治指南（現(xiàn)行版）推薦的采樣要求。

（2）血液樣本應(yīng)當(dāng)說明對采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、采血管和抗凝劑，其他樣本應(yīng)說明樣本采集、處理及保存方式。

（3）樣本處理、運送及保存：對血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預(yù)處理、運送條件、保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的要求。如有需要應(yīng)對高于檢測范圍的樣本稀釋方法進行規(guī)定。

5.【適用機型】注明所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6.【檢驗方法】詳細說明試驗操作的各個步驟，包括：

（1）試劑準備及配制方法、注意事項。

（2）詳述待測樣本、相關(guān)校準品及質(zhì)控品核酸提取的條件、步驟及注意事項。

（3）核酸提取/純化方法的詳細介紹。

（4）擴增反應(yīng)前準備：加樣體積、順序等。

（5）PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)設(shè)置及相關(guān)注意事項。

（6）儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標記情況對待測基因及內(nèi)標的熒光通道選擇。

（7）基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。

（8）校準方法的描述。

（9）實驗的有效性判斷：試劑盒內(nèi)陰/陽性質(zhì)控品、內(nèi)標的Ct值要求。

7.【檢驗結(jié)果的解釋】

檢驗結(jié)果應(yīng)用IU/ml表示，結(jié)合陰、陽性質(zhì)控結(jié)果，對低于檢出限未檢出、低于定量限、檢測范圍內(nèi)及高于檢測范圍的檢測結(jié)果分別進行界定。

8.【檢驗方法的局限性】

（1）本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

（2）不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運、儲存及處理過程均有可能導(dǎo)致錯誤的檢測結(jié)果。

（3）明確該試劑僅限于規(guī)定的樣本類型及適用機型。

9.【產(chǎn)品性能指標】詳述以下性能指標：

（1）對相應(yīng)國家參考品的符合情況。

（2）最低檢出限及定量限：說明試劑不同樣本類型的最低檢出濃度和最低定量濃度，簡單介紹最低檢出限/定量限的確定方法以及對最低檢出限/定量限驗證所采用的基因型。

（3）精密度：精密度參考品的組分、濃度及評價標準、評價結(jié)果。

（4）線性范圍：確定線性范圍的方法、濃度范圍、相關(guān)系數(shù)等信息。

（5）對不同基因型的覆蓋：驗證該試劑對HBV不同基因型的檢測效果。

（6）特異性：

①臨床特異性：應(yīng)采用一定數(shù)量的臨床HBV DNA陰性樣本進行驗證。

②交叉反應(yīng)：易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體核酸的驗證情況，建議以列表的方式表示經(jīng)過交叉反應(yīng)驗證的病原體名稱、型別、濃度等信息。

③干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等，應(yīng)注明可接受的最高限值。

④藥物影響：常用抗病毒藥物、干擾素等對檢測結(jié)果的影響，如未進行相關(guān)研究也應(yīng)提供相關(guān)警示說明。

（7）對比試驗研究：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

10.【注意事項】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

（1）有關(guān)人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)校準品、質(zhì)控品或其他可能含有人源物質(zhì)的組分，雖已通過乙型肝炎表面抗原（HbsAg）、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV1/2）、丙型肝炎抗體（抗-HCV）等項目的檢測為陰性，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應(yīng)將這些組分作為潛在傳染源對待。

（2）臨床實驗室應(yīng)嚴格按照《臨床基因擴增實驗室工作規(guī)范》配備設(shè)備及操作人員，應(yīng)嚴格按照說明書要求進行操作。

（三）擬定產(chǎn)品標準及編制說明

擬定產(chǎn)品標準應(yīng)符合國食藥監(jiān)械〔2007〕229號和國食藥監(jiān)械〔2007〕609號文件的相關(guān)規(guī)定。另外，對于國產(chǎn)試劑，應(yīng)參考《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），將擬申報產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內(nèi)容作為附錄附于標準正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類”項中引出該附錄內(nèi)容。附錄中應(yīng)將待測靶基因區(qū)域，引物/探針來源及驗證情況，各種酶的來源、特性以驗證情況等信息的重點內(nèi)容予以明確。

HBV DNA定量檢測試劑的注冊檢測應(yīng)符合相應(yīng)國家參考品檢測要求。產(chǎn)品的性能指標應(yīng)與說明書內(nèi)容相符。

如果擬申報試劑已有相應(yīng)的國家/行業(yè)標準發(fā)布，則企業(yè)標準的要求不得低于上述標準要求。

（四）注冊檢測

根據(jù)國食藥監(jiān)械〔2007〕229號要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)在國家食品藥品監(jiān)督管理局認可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢測機構(gòu)進行連續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。對于已經(jīng)有國家參考品的HBV DNA項目，在注冊檢測時應(yīng)采用相應(yīng)的國家參考品進行。

（五）主要原材料研究資料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、酶、標準品或企業(yè)參考品等的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標準等的相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須穩(wěn)定;如主要原材料源于外購，應(yīng)提供的資料包括：供貨方提供的質(zhì)量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

1.企業(yè)內(nèi)部參考品的制備、定值過程。建議采用滅活病毒的血清/血漿建立參考品，不宜使用質(zhì)粒。

2.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗證資料。

3.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）組分的主要材料（包括引物、探針、內(nèi)標、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標準及實驗研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

（1） 脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的詳細驗證資料。

（2）引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，并對序列準確性、純度、穩(wěn)定性、功能性實驗等的驗證。如為外購，應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

（3） 探針

特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)PAEG或其他適宜方法純化，在5'-端（和/或3'-端）進行標記，如熒光素報告基團或其他發(fā)光標記物，在3'-端標記熒光素淬滅基團，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化,純度應(yīng)達到高效液相色譜純。如為外購，應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜;應(yīng)對探針的核酸序列及標記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物進行核實，并作HPLC分析。

（4） PCR反應(yīng)所需酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性;尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對酶活性有合理驗證;應(yīng)提供有關(guān)保存穩(wěn)定性、活性及功能實驗等的驗證資料。

4.內(nèi)對照（內(nèi)標）、校準品及質(zhì)控品的原料選擇、制備、定值過程及試驗資料。內(nèi)標設(shè)置應(yīng)合理，質(zhì)控品宜采用混合陰性人血漿或血清作為基質(zhì)。

5.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（Dnase）和核糖核酸酶（Rnase）污染。

（六）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

基本生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進行有效控制。

生產(chǎn)工藝研究的資料應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、校準方法、質(zhì)控方法、穩(wěn)定性和有效期，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.反應(yīng)原理介紹。

3.基因位點選擇、PCR方法學(xué)特性介紹。

4. DNA提取純化方法優(yōu)化，建議包含純化步驟，內(nèi)標、校準品、質(zhì)控品均應(yīng)全程參與提取純化，不建議采用煮沸法進行DNA提取。

5.確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度、樣本量、加樣量及反應(yīng)體積等。樣本量應(yīng)不少于200微升，加樣量和反應(yīng)體積參考相應(yīng)行業(yè)標準，經(jīng)研究驗證后確定。

6.確定PCR各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。

7.對于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。

8.不同適用機型的反應(yīng)條件的對比分析，如果有差異應(yīng)分別詳述。

另外，對于試劑盒的內(nèi)標、校準品、質(zhì)控品設(shè)置，建議企業(yè)參考以下要求執(zhí)行：

（1）樣本反應(yīng)管應(yīng)設(shè)置合理的內(nèi)對照（內(nèi)標）以對管內(nèi)抑制可能造成的假陰性結(jié)果進行質(zhì)控。申請人應(yīng)對內(nèi)標的引物、探針和模板的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標熒光通道呈明顯的陽性曲線，但又不能對目的基因的檢測造成競爭性抑制而導(dǎo)致假陰性，對內(nèi)標的Ct應(yīng)有明確的范圍要求。

（2）HBV DNA定量檢測試劑的質(zhì)控品應(yīng)至少設(shè)置三個量級水平的系列質(zhì)控品:臨界陽性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。校準品和質(zhì)控品均應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對整個PCR反應(yīng)過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進行合理質(zhì)量控制。企業(yè)應(yīng)對各種質(zhì)控品的Ct做出明確的范圍要求。

（七）分析性能評估資料

申請人應(yīng)提交生產(chǎn)者在產(chǎn)品研制或成品驗證階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，對于每項分析性能的評價都應(yīng)包括具體研究目的、實驗設(shè)計、研究方法、可接受標準、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計方法等詳細資料。有關(guān)分析性能驗證的背景信息也應(yīng)在申報資料中有所體現(xiàn)，包括實驗地點（實驗室）、適用儀器、試劑規(guī)格、批號、臨床樣本來源等。分析性能評價的實驗方法可以參考相關(guān)的美國臨床實驗室標準化協(xié)會批準指南（CLSI-EP）文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導(dǎo)原則進行。對于HBV DNA定量檢測試劑，建議著重對以下分析性能進行研究。

1. HBV DNA提取

病毒DNA提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，無論申報產(chǎn)品是否含有DNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細的驗證。臨床標本中可能含有各式各樣的PCR抑制物，因此，對于DNA提取試劑的選擇，除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。目前常見的DNA分離純化方法和改良方法各有優(yōu)勢和不足，申請人應(yīng)結(jié)合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇DNA分離/純化試劑，并提供詳細的驗證資料（提取效率、與后續(xù)試驗的配合等）。

2.最低檢出限與定量限（分析靈敏度）

（1）最低檢出限與定量限的確定

建議使用國際參考品/國家參考品進行梯度稀釋并多次檢測，將具有95%以上陽性檢出率的病毒水平作為最低檢出限。建議最低檢出限應(yīng)不高于30IU/ml。

定量限應(yīng)高于或等于檢出限，將多次（至少10次）測量的結(jié)果符合試劑準確度要求的最低病毒水平作為定量限。

（2）最低檢出限和定量限的驗證

申報試劑應(yīng)在最低檢出限或接近最低檢出限的病毒濃度對不同基因型（至少包括B、C、D型）進行驗證，總測試數(shù)不少于60次。定量限的驗證應(yīng)對不同基因型（至少包括B、C、D型）進行驗證，總測試數(shù)不少于40次。

企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢出限/定量限驗證的各個病毒株的來源、型別確認及滴度確認試驗等信息。

3.線性范圍

線性范圍確定的研究應(yīng)使用高值臨床樣本（由可溯源至國家參考品/國際參考品的方法定量）進行梯度稀釋，稀釋液應(yīng)使用經(jīng)確認為陰性的混合人血清或血漿，應(yīng)包含不少于9個濃度（應(yīng)包含接近最低檢測限的臨界值濃度），使用至少3個批次的試劑進行試驗。通過評價一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系及各水平的準確度確定該產(chǎn)品的線性范圍。

4.準確度

對測量準確度的評價依次包括：與國家參考品（和/或國際參考品）的比對研究、回收實驗、方法學(xué)比對等方法，企業(yè)可根據(jù)實際情況選擇合理方法進行研究。

（1）國家/國際參考品驗證

此類檢測試劑有相應(yīng)的國家/國際參考品，應(yīng)使用國家/國際參考品對試劑進行驗證，重點觀察對相應(yīng)參考品檢測結(jié)果的符合情況。

（2）回收試驗。用于評估定量檢測方法準確測定加入純分析物的能力，結(jié)果用回收率表示。通常對樣本進行3～5次回收試驗，取平均值即平均回收率。

回收試驗注意事項：

①加入的標準液體積一般應(yīng)小于樣本體積的10%;

②盡量使加入標準液后樣本中的被測物濃度接近醫(yī)學(xué)決定水平;

③標準物的濃度應(yīng)該足夠高，以得到不同濃度的回收樣本;

④注意基質(zhì)效應(yīng)，盡量采用與臨床待測樣本一致的基質(zhì)

（3）方法學(xué)比對

采用參考方法或國內(nèi)/國際普遍認為質(zhì)量較好的同類試劑作為對比方法，與擬申報試劑同時檢測一批病人樣品，從測定結(jié)果間的相關(guān)性了解擬申報試劑與參比方法間的一致情況。如顯著相關(guān)，說明兩檢測系統(tǒng)對病人標本測定結(jié)果基本相符，對同一份臨床樣本的醫(yī)學(xué)解釋，擬申報試劑與對比方法相比不會產(chǎn)生顯著差異結(jié)果。

在實施方法學(xué)比對前，應(yīng)分別對擬申報試劑和對比試劑進行初步評估，只有在確認兩者都分別符合各自相關(guān)的質(zhì)量標準后方可進行比對試驗。方法學(xué)比對時應(yīng)注意質(zhì)量控制、樣本類型、濃度分布范圍并對結(jié)果進行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。

5.精密度

測量精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標準可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性，具體實驗方法可以參考相關(guān)的美國臨床實驗室標準化協(xié)會批準指南（CLSI-EP）或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進行。企業(yè)應(yīng)對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數(shù)的范圍等。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求：

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除申報試劑（包括提取組分和聚合酶鏈反應(yīng)組分）本身的影響外，還應(yīng)對PCR分析儀、操作者、地點等要素進行相關(guān)的驗證。

（2）合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續(xù)檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實驗室進行重復(fù)實驗以對室間精密度進行評價。

（3）用于精密度評價的質(zhì)控品應(yīng)至少包括四個水平:

①陰性質(zhì)控品：不含乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）的質(zhì)控品，不得檢出陽性（n≥20）。

②臨界陽性質(zhì)控品：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢出限，陽性檢出率應(yīng)高于95%（n≥20）。

③弱陽性質(zhì)控品：待測物濃度呈弱陽性（高于定量限濃度1個數(shù)量級），陽性檢出率為100%且變異系數(shù)（CV）符合標準要求（n≥20）。

④強陽性質(zhì)控品：待測物濃度呈中度至強陽性，陽性檢出率為100%且CV符合標準要求（n≥20）。

6.HBV不同基因型的覆蓋

應(yīng)對乙肝病毒不同基因型（至少包括B、C、D型）進行檢測，重點考察各基因型病毒樣本的分析靈敏度、準確性及精密度指標，每個基因型的病毒樣本稀釋成至少3個濃度水平，對每水平樣本進行重復(fù)測定。

7.特異性

（1）交叉反應(yīng)

①用于HBV DNA檢測試劑交叉反應(yīng)驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀（推薦種類見表1）。

②建議在病毒和細菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細菌感染的水平為10⁶cfu/ml或更高，病毒為10⁵pfu/ml或更高。

③申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標】項中有所體現(xiàn)。

表1 用于交叉反應(yīng)研究的微生物（推薦）

（2）干擾物質(zhì)

①潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)（見表2）和常用的治療藥物如普通IFNα（2a、2b和1b）和聚乙二醇干擾素α（2a和2b）[PegIFNα（2a和2b）]、拉米夫定（lamivudine）、阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）、恩替卡韋（entecavir）、替比夫定（telbivudine）等。

②使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進行驗證，另外，亦建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（最差條件）條件下進行評價。對于常見藥物干擾試驗，建議參照相應(yīng)藥物藥代動力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進行干擾驗證。

③建議在病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進行檢測。

表2 建議用于干擾研究的物質(zhì)（推薦）

*為必須驗證的干擾物質(zhì)。

8.溯源性

應(yīng)提交詳細的溯源性研究資料。企業(yè)制備的企業(yè)內(nèi)部參考品、二級參考品、用于制備商品化校準品的儲備液以及不同基因型的陽性樣本均應(yīng)能夠溯源至國家參考品/國際參考品。使用國家參考品/國際參考品為校準品，應(yīng)用多臺儀器對企業(yè)一級參考品進行校準，以下逐級對企業(yè)二級參考品、校準儲備液、陽性參考品進行校準。

9.其他需注意問題

對于適用多個機型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說明書【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。如適用于不同樣本類型，應(yīng)提交對不同樣本類型一致性的驗證，包括不同抗凝劑、采血管的驗證。

（八）參考值（范圍）確定資料

對于此類試劑，正常人群中不應(yīng)檢出HBV DNA，參考值確定資料主要是指Ct的確認資料，建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認。

（九）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、運輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進行評價。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（十）臨床試驗研究

1.研究方法

對于該類試劑已有同類產(chǎn)品上市，按照法規(guī)要求選擇境內(nèi)已批準上市、臨床普遍認為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，采用擬申報產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。

建議預(yù)實驗選擇兩種對比試劑同時進行驗證，考察其誤差范圍，選擇其中一種作為正式試驗的對比試劑，另一種可作為第三方試劑。對比試劑的適用樣本類型及檢測范圍應(yīng)能夠涵蓋考核試劑的樣本及檢測性能要求，以免造成考核試劑部分性能無法驗證的情況。

對比試驗結(jié)果不一致（檢測值差異較大）的樣本應(yīng)采用公認較好的第三方試劑進行驗證。

2.臨床研究單位的選擇

建議申請人在選擇臨床研究單位時，應(yīng)考慮到各試驗單位之間的平行性和一定的地域代表性，臨床研究單位應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和對比試劑都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準確性及可重復(fù)性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床研究機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗方案中應(yīng)確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各研究單位選用的對比試劑應(yīng)一致，以便進行合理的統(tǒng)計學(xué)分析，同時方案中應(yīng)明確寫明對于對比試驗研究中測定結(jié)果不符的樣本進行確認試驗的第三方試劑或方法。

4.病例選擇及樣本類型

臨床試驗應(yīng)樣本數(shù)需不少于500例，其中應(yīng)主要選擇乙型肝炎患者樣本（陽性樣本），不少于450例。在病例選擇時應(yīng)考慮到地域性的差別，應(yīng)涵蓋不少于10例D基因型，應(yīng)注重不同藥物治療的乙型肝炎患者。陽性樣本應(yīng)覆蓋試劑線性范圍，均勻分布高、中、低值。建議選擇不少于50例的陰性樣本進行比對試驗，陰性樣本主要考慮可能存在的交叉反應(yīng)情況，應(yīng)選擇其他類肝炎病毒感染、其他良性或惡性肝臟疾病患者，以從臨床角度考察其特異性。

臨床試驗中所涉及的樣本類型應(yīng)為實際臨床檢測中常用的樣本類型。對于同時能夠檢測血清和血漿樣本的試劑，應(yīng)對至少50例同一乙型肝炎患者分別采集的血清和血漿樣本進行比對試驗研究，陽性樣本應(yīng)包括強、中、弱陽性及部分陰性樣本。

臨床研究應(yīng)以新鮮樣本為主，如采用庫存樣本應(yīng)另行說明 。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，對于本類產(chǎn)品對比實驗的等效性研究，常用相關(guān)性、線性回歸對log10滴度結(jié)果進行統(tǒng)計分析，考察兩組數(shù)據(jù)之間是否存在相關(guān)性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗假設(shè)，即評價考核試劑與對比試劑是否等效的標準。選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表卡方或kappa檢驗，對檢驗結(jié)果進行符合率分析，計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率。

6.結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑的檢測結(jié)果有不一致（檢測結(jié)果差異較大）的樣本，應(yīng)采用臨床上公認較好的第三種同類試劑進行確認試驗，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進行分析。

7.臨床試驗總結(jié)報告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號）的要求，臨床試驗報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床總結(jié)報告中對以下內(nèi)容進行詳述。

（1）臨床試驗總體設(shè)計及方案描述

①臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

②病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預(yù)期選擇例數(shù)及標準。

③樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

④統(tǒng)計學(xué)方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標準。

（2） 具體的臨床試驗情況

①申報試劑和對比試劑的名稱、批號、有效期及所用機型等信息。

②對各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況、不同基因型分布情況進行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。

③質(zhì)量控制，試驗人員培訓(xùn)、儀器日常維護、儀器校準、質(zhì)控品運行情況，對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結(jié)果評估。

④具體試驗過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本長期保存、結(jié)果不一致樣本的校驗等。

（3） 統(tǒng)計學(xué)分析

①數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

②兩組數(shù)據(jù)結(jié)果的相關(guān)性、線性回歸的結(jié)果。

③對相關(guān)性及線性方程的顯著性檢驗，驗證兩種試劑定量結(jié)果的一致性。

④陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。

⑤以交叉表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表卡方或kappa檢驗。

另外考慮到對不同樣本類型的檢測結(jié)果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類型分別進行統(tǒng)計分析，以對考核試劑的臨床性能進行綜合分析。

（4） 討論和結(jié)論

對總體結(jié)果進行總結(jié)性描述并簡要分析試驗結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結(jié)論。

四、名詞解釋

精密度（precision）：在規(guī)定條件下，相互獨立的測試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計學(xué)方法得到的測量不精密度的數(shù)字形式表示，如標準差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

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