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流式細(xì)胞儀配套用檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則
（2013年第3號(hào)）

一、前言

本指導(dǎo)原則旨在為注冊申請人準(zhǔn)備及撰寫流式細(xì)胞儀配套用檢測試劑注冊申報(bào)資料提供指導(dǎo)，同時(shí)也為技術(shù)審評部門對注冊申報(bào)資料進(jìn)行技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是對流式細(xì)胞儀配套用檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

二、適用范圍

流式細(xì)胞分析是一種在功能水平上對單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析的檢測手段，可以在短時(shí)內(nèi)高速分析大量細(xì)胞或生物粒子的物理和化學(xué)特征參數(shù)。流式細(xì)胞分析主要靠流式細(xì)胞儀和各種特定發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的單克隆抗體試劑組合檢測來實(shí)現(xiàn)。流式細(xì)胞儀是集電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體理論等技術(shù)原理于一體進(jìn)行流式細(xì)胞分析的儀器，其工作原理為：將待測細(xì)胞或微粒進(jìn)行特異性染色標(biāo)記后制成單細(xì)胞或微粒的懸液標(biāo)本，在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動(dòng)室，用不含細(xì)胞或微粒的緩沖液（鞘液）在高壓下從鞘液管噴出，包繞著細(xì)胞或微粒高速流動(dòng)形成圓形流束（鞘流），依次通過流式細(xì)胞儀的檢測區(qū)域。被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。前向散射光和側(cè)向散射光檢測器把散射光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，熒光則被聚光器收集，不同顏色熒光被雙色反光鏡轉(zhuǎn)向不同的光電倍增管檢測器，把熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。散射光信號(hào)和熒光信號(hào)經(jīng)過放大后，再經(jīng)過數(shù)據(jù)化處理輸入電腦并儲(chǔ)存，根據(jù)散射光和熒光信號(hào)對細(xì)胞或微粒進(jìn)行分類或計(jì)數(shù)。其中，前向散射光反映了細(xì)胞體積的大小，側(cè)向散射光則反應(yīng)細(xì)胞部分結(jié)構(gòu)的信息;熒光信號(hào)強(qiáng)度代表了所測細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或其細(xì)胞內(nèi)、核內(nèi)物質(zhì)的濃度。臨床流式細(xì)胞分析是將流式細(xì)胞分析技術(shù)與方法應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，與臨床疾病的診斷、分型、治療、預(yù)后及預(yù)防等相結(jié)合的綜合應(yīng)用學(xué)科。其應(yīng)用范圍廣泛，包括細(xì)胞生物學(xué)、血液免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、感染性疾病、造血干細(xì)胞移植、器官移植等多個(gè)方面。臨床流式細(xì)胞分析要求實(shí)驗(yàn)人員對整個(gè)分析系統(tǒng)、各種相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法有深入理解和掌握，并能對檢測結(jié)果給予合理的醫(yī)學(xué)解釋。

本指導(dǎo)原則中“流式細(xì)胞儀配套用檢測試劑”是指標(biāo)記有熒光類物質(zhì)（如熒光素、量子點(diǎn)等）、針對各類血細(xì)胞或組織細(xì)胞分化抗原的單克隆抗體試劑以及相關(guān)的質(zhì)控品和校準(zhǔn)品，這些抗體與血細(xì)胞或組織細(xì)胞的各類抗原分子特異性結(jié)合，與相應(yīng)流式細(xì)胞儀配套使用，對人血液、骨髓液、其他體液或組織標(biāo)本中的被標(biāo)記細(xì)胞或分子進(jìn)行分類和計(jì)數(shù)。由于多方面差異，本文內(nèi)容將不包括預(yù)期用途為利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行特異性目的細(xì)胞分選的檢測試劑。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。

三、基本要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、方法學(xué)特征、生物安全性評價(jià)、研究結(jié)果總結(jié)以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監(jiān)械〔2007〕229號(hào)）和《體外診斷試劑注冊申報(bào)資料形式與基本要求》（國食藥監(jiān)械〔2007〕609號(hào)）的相關(guān)要求。

（二）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、實(shí)驗(yàn)操作方法、檢測結(jié)果解釋以及相關(guān)注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，也是體外診斷試劑注冊申報(bào)的重要文件之一。流式細(xì)胞儀檢測專業(yè)性較強(qiáng)，對產(chǎn)品說明書的編制進(jìn)行必要的指導(dǎo)顯得更為重要。該類產(chǎn)品說明書除對單克隆抗體試劑做必要的介紹外，還應(yīng)對樣本采集、樣本處理及保存、儀器校準(zhǔn)、檢測質(zhì)量控制、結(jié)果分析等相關(guān)步驟作詳細(xì)描述，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號(hào)）的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性及完整性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。結(jié)合相關(guān)法規(guī)要求及流式細(xì)胞分析的特性，下面對流式細(xì)胞儀配套用檢測試劑說明書的重點(diǎn)內(nèi)容作詳細(xì)說明，以指導(dǎo)注冊申報(bào)人員更合理地完成說明書編制。

1.【產(chǎn)品名稱】

單色試劑通用名稱建議采取以下命名方式：被檢標(biāo)志物名稱+檢測試劑盒（流式細(xì)胞儀法-熒光素）。多色試劑的命名可以結(jié)合靶抗原、目標(biāo)細(xì)胞或組織、熒光素及臨床預(yù)期用途等信息綜合進(jìn)行判斷。

2.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

（1）適用的樣本類型：如血液、骨髓液、其他體液或組織細(xì)胞等，并明確對所需抗凝劑的要求。

（2）待測靶抗原的特征簡介，如分子結(jié)構(gòu)、分子量、產(chǎn)生和代謝主要途徑、表達(dá)細(xì)胞等。

（3）與被檢標(biāo)志物相關(guān)的臨床背景介紹、正常表達(dá)情況、異常表達(dá)的主要疾病等。

（4）強(qiáng)調(diào)：實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)接受過流式細(xì)胞儀檢測的專業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作資格，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備合理的生物安全防備設(shè)施及防護(hù)程序。

3.【主要組成成分】

（1）主要是對特定熒光素標(biāo)記的單克隆抗體特征的描述，應(yīng)包括抗體特異性，雜交瘤細(xì)胞，免疫球蛋白特征，熒光激發(fā)及發(fā)射波長，偶聯(lián)的熒光素，抗體濃度以及其他非抗體成分組成及濃度。

（2）如包括多種不同熒光素標(biāo)記的單克隆抗體，則應(yīng)對不同的抗體分別列表詳述上述特征。

（3）建議將實(shí)驗(yàn)需要但本試劑盒未提供的主要材料進(jìn)行列舉：如與之配套使用的紅細(xì)胞溶解試劑、稀釋劑、細(xì)胞/血球計(jì)數(shù)儀等。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

包括試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性等有關(guān)試劑保存的重要信息;如有必要,應(yīng)注明試劑表面變化或變質(zhì)時(shí)情況的描述及相關(guān)警示。

5.【樣本要求】

樣本采集和處理的目標(biāo)是獲得均勻的單細(xì)胞或其他生物微粒的懸液，同時(shí)必須盡量保證其活力和完整性。樣本操作不宜過度，避免對其結(jié)構(gòu)和抗原性造成破壞。故對于流式細(xì)胞分析而言，樣本處理對實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要，應(yīng)盡量減少由于樣本采集或處理不當(dāng)對實(shí)驗(yàn)造成的影響。

在產(chǎn)品說明書中應(yīng)重點(diǎn)對以下內(nèi)容予以明確：

（1）所需的樣本量、采樣方法（對抗凝劑或抗凝管的要求）及樣本采集的注意事項(xiàng)，盡量引述相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

（2）樣本處理：溶血洗滌（或非洗滌）、細(xì)胞分離和提純描述、離心和固定等方法;樣本保存、轉(zhuǎn)運(yùn)的條件和方法。

（3）染色前穩(wěn)定性：即采樣后在合理的保存條件下，多長時(shí)間內(nèi)必須進(jìn)行抗體標(biāo)記（染色）;如果不同抗凝劑樣本的穩(wěn)定時(shí)間有差異，則應(yīng)分別進(jìn)行闡述。

（4）染色后穩(wěn)定性：即樣本在完成抗體標(biāo)記后至上機(jī)分析前可以穩(wěn)定保存的條件及期限，最好結(jié)合染色前穩(wěn)定性的要求對上機(jī)分析前的穩(wěn)定性進(jìn)行綜合闡述。

（5）避免使用的樣本類型，如有微生物污染、乳糜、凝集或細(xì)胞活力不達(dá)標(biāo)準(zhǔn)等，在一般情況下應(yīng)避免使用上述樣本，除非樣本有不可替代性，則應(yīng)說明處理該種樣本的方法，并應(yīng)在結(jié)果報(bào)告時(shí)明示。

（6）達(dá)到最佳染色效果所要求的目標(biāo)細(xì)胞濃度、計(jì)數(shù)方法及相關(guān)注意事項(xiàng)。

（7）樣本處理過程可能對細(xì)胞活性造成一定影響而導(dǎo)致活性細(xì)胞的比例降低，如果細(xì)胞活性對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋非常重要，生產(chǎn)商需提供細(xì)胞活性的評估方法，避免非活性細(xì)胞的非特異性結(jié)合從而影響檢測結(jié)果。

（8）優(yōu)化為最佳染色效果所需注意的重要信息;其他有關(guān)樣本采集、處理及保存的注意事項(xiàng)。

6.【適用機(jī)型】所有適用的儀器型號(hào)，如對配套用軟件有要求也應(yīng)做說明，并提供與儀器或軟件有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

7.【檢驗(yàn)方法】對于流式細(xì)胞分析而言，實(shí)驗(yàn)操作步驟對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響至關(guān)重要，因此，應(yīng)詳細(xì)說明達(dá)到最佳染色效果的實(shí)驗(yàn)操作各個(gè)步驟，包括：

（1）試劑使用條件：溫度/濕度條件（如有必要）、試劑用量、染色時(shí)間、是否需無菌操作等。

（2）簡述試驗(yàn)開始前流式細(xì)胞儀的設(shè)置方法，校準(zhǔn)及質(zhì)控程序。

（3）詳細(xì)闡述試驗(yàn)操作步驟、注意事項(xiàng)。如對照的設(shè)定方式及類別（同型陰性對照、陽性對照、正常人血細(xì)胞對照等），設(shè)門方法舉例及代表性數(shù)據(jù)圖示;靶細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的方法及步驟、計(jì)算公式以及相關(guān)注意事項(xiàng)。

（4）校準(zhǔn)：適用校準(zhǔn)品的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱及貨號(hào)等詳細(xì)信息，校準(zhǔn)品的使用方法、推薦的校準(zhǔn)周期及相關(guān)注意事項(xiàng)。

（5）質(zhì)量控制：適用質(zhì)控品的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱及貨號(hào)等詳細(xì)信息，如果質(zhì)控品和病人樣本的使用方法不同，生產(chǎn)商應(yīng)注明必要的指導(dǎo)和解釋。建議在質(zhì)量控制環(huán)節(jié)注明以下字樣：“如果質(zhì)控結(jié)果與預(yù)期不符，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)以保證結(jié)果的可靠性。如不能獲得可靠性結(jié)果，則不應(yīng)出具檢測報(bào)告?！睂?shí)驗(yàn)室應(yīng)負(fù)責(zé)質(zhì)量控制失敗的解決方案。

8.【參考值（參考范圍）】

應(yīng)注明待測標(biāo)記細(xì)胞或分子在常用樣本類型的正常參考值（范圍），簡單介紹設(shè)定該參考值（范圍）所選健康人群的特征，如有必要，需對不同年齡段人群、不同性別或具有明確地理差異人群的參考值分別進(jìn)行詳述。

建議注明以下字樣“由于地理、人種、性別及年齡等差異，建議各實(shí)驗(yàn)室建立自己的參考值（范圍）”。

9.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

由于流式細(xì)胞儀分析技術(shù)的專業(yè)性較強(qiáng)，檢測過程中的影響因素較多且同一分析目標(biāo)在不同人群的表達(dá)復(fù)雜多樣，因此，流式細(xì)胞檢測的數(shù)據(jù)分析、結(jié)果解釋和出具臨床報(bào)告經(jīng)常具有較大的挑戰(zhàn)性，結(jié)果解釋不當(dāng)可能對病人的診治造成很大影響。建議負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)解釋和出具報(bào)告的實(shí)驗(yàn)人員需經(jīng)過正規(guī)的技術(shù)培訓(xùn)且有一定的臨床經(jīng)驗(yàn)，二者結(jié)合有助于對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作出合理的醫(yī)學(xué)解釋。

產(chǎn)品說明書中的本部分內(nèi)容應(yīng)對上述情況進(jìn)行必要的建議，還應(yīng)對設(shè)門方法、數(shù)據(jù)分析、異常值處理、臨床相關(guān)提示等內(nèi)容作出合理解釋。

10.【檢驗(yàn)方法局限性】

（1）本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

（2）使用該試劑的其他限制，如樣本、保存方法、保存時(shí)間，特殊患者可能出現(xiàn)的不正確結(jié)果，儀器設(shè)置不當(dāng)?shù)挠绊懙取?/p>

（3）是否與經(jīng)其他試劑或儀器獲得的同類數(shù)據(jù)具直接可比性。

11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 詳述以下性能指標(biāo)：

（1）精密度：簡要說明精密度評價(jià)的方法，建議以列表的方式列出批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間、運(yùn)行內(nèi)/運(yùn)行間精密度等信息，以標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）的形式表示精密度研究結(jié)果。

（2）線性：包括細(xì)胞計(jì)數(shù)濃度范圍和待測目標(biāo)物陽性細(xì)胞百分比濃度范圍兩類，申請人應(yīng)對適于待測標(biāo)記物的至少一個(gè)指標(biāo)進(jìn)行合理驗(yàn)證，簡要注明實(shí)驗(yàn)方法、所用儀器及軟件等信息。

（3）對比試驗(yàn)研究：簡要介紹參比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果、圖示。

（4）分析特異性：有關(guān)交叉反應(yīng)和干擾因素的驗(yàn)證信息或風(fēng)險(xiǎn)分析。如：對溶血、高脂、黃疸等內(nèi)源性干擾因子的濃度限值要求，樣本中可能存在某些內(nèi)生物質(zhì)與待測抗原有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)或抗原表位，如自身抗體、蛋白、激素或近期服用的某些藥物（如生物制劑），這些物質(zhì)可能與試劑中的單克隆抗體發(fā)生交叉反應(yīng)而影響檢測結(jié)果，如未進(jìn)行相關(guān)研究也應(yīng)提供相關(guān)警示說明。

12.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

（1）生物安全性警告：接觸到的臨床樣本、質(zhì)控/校準(zhǔn)品、實(shí)驗(yàn)廢棄物等材料應(yīng)當(dāng)作為潛在傳染物進(jìn)行處理，并且采用符合法規(guī)的預(yù)防措施對其處理。

（2）有關(guān)儀器設(shè)置的警示，如：流式細(xì)胞儀未經(jīng)正確校準(zhǔn)、熒光滲漏未行合理補(bǔ)償以及檢測區(qū)域（設(shè)門）未精確定位，則可能產(chǎn)生錯(cuò)誤的檢測結(jié)果。

（3）有關(guān)試劑準(zhǔn)備的注意事項(xiàng)：如冷藏避光保存、切勿冷凍、使用前恢復(fù)室溫等。

（4）針對某些白細(xì)胞濃度過高或過低的情況，在樣本處理時(shí)需采用的特殊處理方式，如血樣稀釋或細(xì)胞濃縮等操作。

（5）試劑特殊成分或操作使用試劑危害性的警告及注意事項(xiàng)：如疊氮化鈉、甲醛等;使用不當(dāng)?shù)奶幚矸绞健?/p>

（6）保證試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的其他操作注意事項(xiàng)。

（三）擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)及編制說明

擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合國食藥監(jiān)械〔2007〕229號(hào)和國食藥監(jiān)械〔2007〕609號(hào)文件的相關(guān)規(guī)定。另外，對于國產(chǎn)第三類體外診斷試劑，應(yīng)參考《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），將擬申報(bào)產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內(nèi)容作為附錄附于標(biāo)準(zhǔn)正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類”項(xiàng)中引出該附錄內(nèi)容。

該類產(chǎn)品注冊檢測的技術(shù)要求主要包括：準(zhǔn)確度、線性、精密度、染色穩(wěn)定性等相關(guān)指標(biāo)，具體要求的設(shè)置應(yīng)參考相關(guān)的國家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（如有）執(zhí)行，企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求不得低于國家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

（四）注冊檢測

對于首次注冊產(chǎn)品，申請人擬定申報(bào)產(chǎn)品的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)后，應(yīng)當(dāng)在國家食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。

對于已經(jīng)有國家參考品的流式細(xì)胞檢測項(xiàng)目，在注冊檢測時(shí)應(yīng)采用相應(yīng)的國家參考品進(jìn)行,對于目前尚無國家參考品的項(xiàng)目，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立自己的質(zhì)控體系并提供相應(yīng)的內(nèi)部參考品。

（五）主要原材料研究資料

應(yīng)提供主要原材料如單克隆抗體、標(biāo)記熒光素的選擇、來源、制備過程、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)檢報(bào)告等研究資料。若主要原材料為企業(yè)自行生產(chǎn)，則應(yīng)詳述原材料（主要是單克隆抗體）的制備及生產(chǎn)過程、雜交瘤細(xì)胞的選擇、技術(shù)指標(biāo)、質(zhì)量控制、國際相關(guān)權(quán)威機(jī)構(gòu)（如國際人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組織）的認(rèn)證情況（如有）等;如主要原材料來自外購，則應(yīng)詳述抗體的名稱及生物學(xué)來源，外購方名稱，提交外購方出具的有關(guān)單克隆抗體和/或雜交瘤細(xì)胞的性能分析或檢驗(yàn)證書，詳述申請人對該抗體技術(shù)指標(biāo)的要求以及申請人確定該抗體作為主要原材料的依據(jù)。對熒光染色方法、染料選擇依據(jù)、標(biāo)記熒光穩(wěn)定性，多色標(biāo)記中熒光的交叉重疊驗(yàn)證等研究。質(zhì)控品、校準(zhǔn)品原料選擇、制備、定值過程及試驗(yàn)資料;校準(zhǔn)品溯源性文件等。

（六）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1.生產(chǎn)工藝的研究資料主要包含：

（1）主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式（工藝流程圖）表示。

（2）生產(chǎn)工藝中關(guān)鍵步驟的質(zhì)量控制要求及質(zhì)控方法。

（3）生產(chǎn)商所采用的生產(chǎn)工藝和方法的驗(yàn)證資料。

2.反應(yīng)體系的研究資料主要包含：

（1）反應(yīng)原理介紹。

（2）產(chǎn)品說明書中描述的所選反應(yīng)條件各步驟的分析性能數(shù)據(jù)，例如需要的樣本體積，樣本的處理、保存時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間、溫度的確定，抗體的用量（重要），是否需反向加樣、溶血/洗滌操作，去除干擾等。

（3）應(yīng)說明配合該產(chǎn)品所使用的分析方法并進(jìn)行驗(yàn)證，如不同平臺(tái)方法、不同軟件分析、操作注意事項(xiàng)等。

（4）不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。

（5）質(zhì)量控制：同型陰性對照、正常成人樣本對照、商業(yè)化陽性質(zhì)控品、熒光信號(hào)與散射光結(jié)合對各細(xì)胞群的確認(rèn)等。

（七）分析性能評估資料

申請人應(yīng)提交企業(yè)在產(chǎn)品研制或成品驗(yàn)證階段對試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，對于每項(xiàng)性能的評價(jià)，都應(yīng)包括研究目的、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)室）、適用儀器、所用軟件、臨床樣本來源等。對用于多色流式細(xì)胞分析的試劑（如CD3/CD4/CD8淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑），其待測每個(gè)指標(biāo)（如CD3、CD4和CD8三個(gè)指標(biāo)）及主要組合形式的所有分析性能均應(yīng)分別進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。分析性能評價(jià)的實(shí)驗(yàn)方法可以參考國際或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進(jìn)行。

1.準(zhǔn)確度

對測量準(zhǔn)確度的評價(jià)主要包括：與國家標(biāo)準(zhǔn)品（和/或國際標(biāo)準(zhǔn)品）的偏差分析和方法學(xué)比對兩種方法，企業(yè)可根據(jù)實(shí)際情況選擇合理方法進(jìn)行研究。

（1） 國家（國際）標(biāo)準(zhǔn)品的檢測及偏倚情況

如果研究項(xiàng)目有相應(yīng)國家（國際）標(biāo)準(zhǔn)品，則使用國家（國際）標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗(yàn)證，重點(diǎn)觀察對相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果的偏差情況。

（2）方法學(xué)比對

采用國內(nèi)/國際普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的已上市同類試劑作為參比方法，與擬申報(bào)試劑同時(shí)檢測一批樣品，從測定結(jié)果間的差異了解擬申報(bào)試劑與參比方法間的偏倚。如偏倚很小或在允許的誤差范圍內(nèi)，說明兩檢測系統(tǒng)對病人標(biāo)本測定結(jié)果基本相符，對同一份臨床樣本的醫(yī)學(xué)解釋，擬申報(bào)試劑與參比方法相比不會(huì)產(chǎn)生差異結(jié)果。方法學(xué)比對時(shí)，企業(yè)應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行申報(bào)試劑和參比試劑產(chǎn)品說明書的要求，著重注意質(zhì)量控制、樣本采集及處理、實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置等事項(xiàng);濃度分布范圍及可接受標(biāo)準(zhǔn)、合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等要素均應(yīng)在注冊文件中予以說明。

2.精密度：

精密度是指在規(guī)定的檢測條件下，相互獨(dú)立的測試結(jié)果間的一致程度，本類試劑的精密度評價(jià)主要考慮細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和熒光強(qiáng)度兩方面。建議采用多個(gè)水平的質(zhì)控物質(zhì)用于細(xì)胞計(jì)數(shù)精密度的評價(jià)，各個(gè)濃度均應(yīng)在試劑盒的線性范圍內(nèi)且有一定的臨床意義（醫(yī)學(xué)決定水平），通常包括該檢測指標(biāo)的正常范圍、異常低值和高值樣本。企業(yè)可根據(jù)不同情況，采用質(zhì)控品、特定細(xì)胞株、正?；虍惓Ｈ巳簶颖緛碜鼍芏仍u估。

對于質(zhì)控品或校準(zhǔn)品的精密度評價(jià)，應(yīng)包括其所有質(zhì)控或校準(zhǔn)項(xiàng)目，如熒光信號(hào)及散射光要求等。

在進(jìn)行精密度評價(jià)時(shí)，除申報(bào)試劑本身的影響外，還應(yīng)對操作者、適用機(jī)型、不同軟件及實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。企業(yè)應(yīng)制定合理的精密度評價(jià)方案，例如：在每個(gè)適用機(jī)型上進(jìn)行至少20天（工作日）的連續(xù)檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整運(yùn)行，每天內(nèi)兩次運(yùn)行間的時(shí)間間隔不少于3小時(shí)，從而對批內(nèi)/批間、日間、運(yùn)行內(nèi)/運(yùn)行間、不同操作者間的精密度以及各變量綜合的總精密度進(jìn)行評價(jià)。

3.線性范圍：

本類產(chǎn)品線性主要包括稀釋細(xì)胞濃度范圍和標(biāo)記抗體陽性細(xì)胞的百分率范圍兩種線性范圍。企業(yè)可根據(jù)實(shí)際需要及以往的研究習(xí)慣自行選擇其中一種對線性的要求進(jìn)行驗(yàn)證。企業(yè)應(yīng)對每個(gè)測量參數(shù)建立合理的線性范圍，在建立一個(gè)參數(shù)的線性范圍時(shí)，應(yīng)該盡量將預(yù)期測定范圍加寬，在合理范圍內(nèi)選擇7～11個(gè)濃度水平，每個(gè)水平2～4份復(fù)制液，取每個(gè)濃度水平重復(fù)測量的均值用于線性回歸分析，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果逐漸減少數(shù)據(jù)點(diǎn)直至表現(xiàn)出最寬的線性范圍，如采用回歸方法統(tǒng)計(jì)線性分析的結(jié)果，則擬合回歸直線的判定系數(shù)（R2）應(yīng)不小于0.95。

建立稀釋細(xì)胞濃度線性范圍時(shí)，所用的樣本基質(zhì)應(yīng)盡可能與臨床實(shí)際檢測的樣本相似，建議采用混合血漿或自體血漿進(jìn)行稀釋，同時(shí)應(yīng)考慮多倍稀釋可能造成的基質(zhì)效應(yīng)。對于標(biāo)記抗體陽性細(xì)胞百分率的線性范圍，建議企業(yè)選擇經(jīng)確認(rèn)的陽性細(xì)胞株和陰性細(xì)胞株按照恒定的細(xì)胞總數(shù)將兩種細(xì)胞進(jìn)行不同比率的混合，陽性細(xì)胞數(shù)與陰性細(xì)胞數(shù)比例可以從0%到100%不等，從而確認(rèn)合理的有關(guān)陽性細(xì)胞百分率的線性范圍。

4.分析特異性

（1）采用多種方法對申報(bào)抗體與靶抗原結(jié)合的特異性驗(yàn)證研究，如采用競爭性抑制法、抗體與抗原純品的結(jié)合研究、免疫印跡技術(shù)或胞膜抗原的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)等方法對抗原抗體結(jié)合的特異性進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證;有關(guān)靶抗原的細(xì)胞或組織分布特異性的研究，如抗體與不同細(xì)胞系的反應(yīng)譜等。

（2）交叉反應(yīng)性：通過實(shí)驗(yàn)或風(fēng)險(xiǎn)分析驗(yàn)證所申報(bào)單克隆抗體除與目標(biāo)抗原的結(jié)合外，是否與樣本中可能存在其他內(nèi)生或外源物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，如：與待測抗原有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)或抗原表位的蛋白、激素或近期服用的某些藥物等。

（3）干擾：本處所指的干擾是指經(jīng)過生產(chǎn)商指定的樣本處理方法后，檢測時(shí)是否還存在其他影響結(jié)果的干擾因素或干擾物質(zhì)。如有，生產(chǎn)商應(yīng)進(jìn)行說明并驗(yàn)證（使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗(yàn)證）;另外，亦建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（最差條件）條件下進(jìn)行評價(jià)。

（八）參考值（范圍）確定資料

研究資料應(yīng)詳細(xì)描述用于參考值（范圍）確定健康人群的地域、年齡、性別等特征，并對統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行詳細(xì)解釋?？梢詤⒖紘鴥?nèi)或國際有關(guān)參考值（范圍）制定的指南文件推薦的方法進(jìn)行。不同種族、年齡或性別人群如有明顯差異應(yīng)分別進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析并設(shè)置不同的參考值（范圍）。

（九）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、高溫加速破壞穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性以及開瓶穩(wěn)定性等研究，申請人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

樣本穩(wěn)定性主要考慮染色前和染色后穩(wěn)定性，前者是指樣本采集后至染色（標(biāo)記）前的穩(wěn)定性，后者是指染色（標(biāo)記）后到上機(jī)分析前的穩(wěn)定性。樣本染色前、染色后穩(wěn)定性需結(jié)合試劑的穩(wěn)定性研究綜合進(jìn)行考慮，建議在試劑實(shí)時(shí)（效期）穩(wěn)定性的終止日期后開展樣本穩(wěn)定性的研究，這樣可以代表最差條件的穩(wěn)定性?？梢栽诤侠淼臏囟确秶鷥?nèi)選擇多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每間隔一定的時(shí)間段對采集樣本或標(biāo)記后樣本進(jìn)行陽性細(xì)胞比例（或絕對數(shù)）及熒光強(qiáng)度變化率的分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)樣本染色前和染色后的合理保存條件和有效期。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】兩項(xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說明。

（十）臨床試驗(yàn)研究

1.樣本例數(shù)

考慮到流式細(xì)胞儀配套用檢測試劑種類繁多、臨床用途廣泛但主要原材料、生產(chǎn)工藝及檢測原理等非常相似的特點(diǎn)，該類試劑臨床試驗(yàn)研究的總樣本數(shù)為不少于500例。

2.臨床研究單位的選擇

流式細(xì)胞儀配套用檢測試劑的臨床研究應(yīng)在三家以上（含三家）省級(jí)醫(yī)療衛(wèi)生單位進(jìn)行，對于特殊使用目的產(chǎn)品可以在相應(yīng)的市級(jí)以上?？漆t(yī)院或其他診療機(jī)構(gòu)開展臨床研究。建議在國內(nèi)不同城市選擇臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本有一定地域代表性;臨床研究單位須具有流式細(xì)胞儀專業(yè)的技術(shù)人員及相應(yīng)的儀器設(shè)備，確保該項(xiàng)研究的實(shí)施。實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價(jià)方案。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，考核試劑和參比試劑都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，定期對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。流式細(xì)胞儀檢測的專業(yè)性較強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)操作人員須接受過流式細(xì)胞儀技術(shù)的專業(yè)培訓(xùn)，并經(jīng)過考核合格后上崗，具備實(shí)驗(yàn)室檢測和臨床病情相結(jié)合的流式細(xì)胞儀相關(guān)的檢測經(jīng)驗(yàn)。

3.研究方法

（1）境內(nèi)已有同類試劑批準(zhǔn)上市產(chǎn)品的臨床研究：

選擇中國境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對照試劑，采用擬申報(bào)產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進(jìn)行對比試驗(yàn)研究，證明考核試劑與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。

（2）境內(nèi)尚無同類試劑批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品臨床研究：

可以選擇國外已上市、普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對照試劑，采用考核試劑與之進(jìn)行對比試驗(yàn)研究，證明本品與對照試劑等效或優(yōu)于對照試劑。同時(shí)，還應(yīng)結(jié)合每個(gè)患者的臨床病情對申報(bào)試劑的檢測結(jié)果進(jìn)行綜合判斷，如有必要，需對研究對象進(jìn)行相關(guān)的跟蹤監(jiān)測研究，以綜合評價(jià)申報(bào)試劑的檢測結(jié)果，驗(yàn)證其與臨床病情的一致性。

4.試驗(yàn)方案

臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。整個(gè)試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床研究機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

5.臨床病例選擇

絕大多數(shù)采用流式細(xì)胞儀方法檢測的血細(xì)胞或組織細(xì)胞抗原對于疾病診斷的靈敏度和特異性較低，與器官/組織定位、疾病良惡性區(qū)分以及與病情的進(jìn)展程度雖有一定關(guān)聯(lián)但多無明確的量值-病情相關(guān)關(guān)系，而且，多數(shù)情況下，該類試劑在用于病變的診療時(shí)需要多個(gè)標(biāo)記物組合檢測才能體現(xiàn)其臨床意義。因此，在進(jìn)行臨床研究時(shí)，除有針對性選擇目的性較強(qiáng)的病例外，還應(yīng)選擇部分其他相關(guān)的抗原表達(dá)類似或需鑒別診斷的病例。

臨床研究試驗(yàn)中應(yīng)包括對部分來自健康人群的樣本作為正常對照。驗(yàn)證試劑的正常參考值（范圍），比較正常組和疾病組結(jié)果，以便對申報(bào)產(chǎn)品的臨床性能作出全面分析。建議對健康人群例數(shù)的選擇以不超過120例為宜。對于臨床意義有待明確或發(fā)病率極低（陽性樣本較難獲得）的試劑，可適當(dāng)增加正常樣本數(shù)。不管是健康人群或不同病種的患者，每一組受試者的最小入選人數(shù)均須滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的基本要求。

6.結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

數(shù)據(jù)分析時(shí)，對于兩種試劑的檢測結(jié)果有明顯差異或與臨床方案中的標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)偏差的樣本，臨床試驗(yàn)研究人員應(yīng)對差異原因進(jìn)行合理分析，包括樣本處理、檢測操作、設(shè)門/分析過程中可能出現(xiàn)的干擾或錯(cuò)誤，差異樣本亦可能由于樣本的個(gè)體差異所致。如果經(jīng)綜合分析無法確認(rèn)差異原因，且偏差樣本有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則應(yīng)進(jìn)行必要的重復(fù)檢測并采用公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法或第三方試劑進(jìn)行復(fù)核。

7.統(tǒng)計(jì)方法：對臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，如相關(guān)分析、線性回歸、生存分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析等。對于對比實(shí)驗(yàn)的等效性研究，最常用是對實(shí)驗(yàn)試劑和對照試劑的兩組檢測結(jié)果的相關(guān)及線性回歸分析，如適用，應(yīng)重點(diǎn)觀察相關(guān)系數(shù)（r值）或判定系數(shù)（R2）、回歸方程斜率（b）及y軸截距（a）等指標(biāo)。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，即評價(jià)實(shí)驗(yàn)試劑與對照試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。

8.臨床試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告

根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號(hào)）的要求，臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。建議在臨床總結(jié)報(bào)告中對以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。

（1）臨床試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及方案描述

①臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

②病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、不同病種的預(yù)期選擇例數(shù)及健康人群的選擇標(biāo)準(zhǔn)。

③樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

④統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、統(tǒng)計(jì)軟件、評價(jià)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。

（2）具體的臨床試驗(yàn)情況

①考核試劑和參比試劑的名稱、批號(hào)、有效期及所用機(jī)型等信息;考核試劑該批次自檢或經(jīng)其他機(jī)構(gòu)檢測合格情況;參比試劑的境內(nèi)外批準(zhǔn)情況等信息。

②對各研究單位的病例數(shù)、病種分布情況進(jìn)行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。

③質(zhì)量控制，試驗(yàn)人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、儀器校準(zhǔn)、質(zhì)控品運(yùn)行情況，對檢測精密度、質(zhì)控品回收（或測量值）、抽查結(jié)果評估。

④具體試驗(yàn)過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本長期保存、結(jié)果不一致樣本的校驗(yàn)等。

（3）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

①數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗(yàn)證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

②相關(guān)性和一致性分析

可以采用線性回歸的方式驗(yàn)證兩種試劑結(jié)果的相關(guān)性，以y=a+bx和R2的形式列出回歸分析的擬合方程，其中：y是考核試劑結(jié)果，x是參比試劑結(jié)果，b是方程斜率，a是y軸截距，R2是判定系數(shù)，同時(shí)應(yīng)給出b的95%（或99%）置信區(qū)間，定量值結(jié)果應(yīng)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

另外考慮到某些檢測指標(biāo)在不同的樣本濃度區(qū)間、不同年齡段人群或不同疾病來源的樣本可能有較明顯的差異，因此，如有必要，建議以上述相關(guān)要素為依據(jù)分組并對各組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以更好的驗(yàn)證兩種試劑的相關(guān)性。

（4）討論和結(jié)論

對總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡要分析試驗(yàn)結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。

四、名詞解釋

1.準(zhǔn)確度（accuracy）：一個(gè)測量值與可接受的參考值間的一致程度。

2.精密度（precision）：在規(guī)定條件下，相互獨(dú)立的測試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得到的測量不精密度的數(shù)字形式表示，如標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

3.線性（linearity）：在給定測量范圍內(nèi)，給出的測量結(jié)果與樣品中實(shí)際存在的被測量物的值成比例的能力。線性是描述一個(gè)測量系統(tǒng)的測量示值或測量結(jié)果相關(guān)于樣本的賦值符合直線的屬性。

4.分析特異性（analytical Specificity）：測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時(shí)只測量被測量物的能力。通常以一個(gè)被評估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫(yī)學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度（潛在干擾物包括干擾物和交叉反應(yīng)物）。

五、參考文獻(xiàn)

1.《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監(jiān)械〔2007〕229號(hào)）。

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