附件：EB病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2020年第16號(hào)）.doc

EB病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)EB病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對(duì)EB病毒核酸檢測(cè)試劑技術(shù)審查的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對(duì)其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

EB病毒（Epstein－Barr virus，EBV）為皰疹病毒科，皰疹病毒IV型，是一種嗜人類淋巴細(xì)胞的皰疹病毒。EBV是雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)約172kb，在病毒顆粒中呈線性分子，進(jìn)入受感染細(xì)胞后，其DNA發(fā)生環(huán)化并能自我復(fù)制。淋巴細(xì)胞中潛伏感染的EBV可表達(dá)2種不翻譯成蛋白質(zhì)的RNA（即EBV-encoded RNAs，EBERs），包括EBER1和EBER2，6種核抗原（EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C和LP），2種潛伏期膜蛋白（潛伏膜蛋白，latent membrane protein，LMP），包括LMP1、LMP2A/B。

EBV在人群中感染非常普遍。除原發(fā)性EBV感染可致傳染性單核細(xì)胞增多癥外，EBV還引起慢性活動(dòng)性EBV感染和EBV相關(guān)噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥等非腫瘤性重癥EBV相關(guān)疾病。EBV還與許多腫瘤的診療相關(guān)。針對(duì)不同的EBV感染相關(guān)疾病，選擇適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，對(duì)于EBV感染相關(guān)疾病的診斷和治療十分重要。

本指導(dǎo)原則所述EB病毒核酸檢測(cè)試劑指基于分子生物學(xué)相關(guān)方法的核酸檢測(cè)技術(shù)，以EB病毒核酸序列為檢測(cè)靶標(biāo)，對(duì)來(lái)自人體樣本（如全血、血漿、血清等）中的EB病毒進(jìn)行體外定量檢測(cè)的試劑。結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，本類產(chǎn)品可用于EB病毒感染實(shí)驗(yàn)室診斷及臨床應(yīng)用。

本指導(dǎo)原則適用于基于實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-time polymerase chain reaction，qPCR）等核酸檢測(cè)方法的EB病毒核酸檢測(cè)試劑。對(duì)于EB病毒定性檢測(cè)或其他方法，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)適用部分進(jìn)行評(píng)價(jià)或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)資料進(jìn)行相應(yīng)性能的驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并說(shuō)明替代方法的科學(xué)合理性。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行產(chǎn)品注冊(cè)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)及病原體檢出能力等方面寫(xiě)明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。對(duì)于本類申報(bào)產(chǎn)品，應(yīng)著重從樣本類型、樣本采集與制備方式、目標(biāo)基因片段的選擇、方法學(xué)特征等方面描述。

（二）主要原材料的研究資料

此類產(chǎn)品的主要原材料應(yīng)包括EB病毒檢測(cè)試劑的所有主要組成成分，如引物、探針、酶、提取成分等。如為申請(qǐng)人自行研制的主要原材料，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)EB病毒目的基因序列確定、引物和探針選擇、酶的選擇和驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)過(guò)程予以詳述；并提供對(duì)各主要原材料的性能研究資料，如：外觀、純度、蛋白濃度、功能性研究等。制備完成的原料成品應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)以確認(rèn)其符合標(biāo)準(zhǔn)要求，整個(gè)生產(chǎn)工藝應(yīng)穩(wěn)定可控。如為申請(qǐng)人外購(gòu)主要原材料，應(yīng)詳述每一原材料外購(gòu)方來(lái)源，提交外購(gòu)方出具的原材料性能指標(biāo)及質(zhì)量控制資料，并詳述申請(qǐng)人對(duì)外購(gòu)主要原材料的各指標(biāo)質(zhì)量要求以及確定該原材料作為本產(chǎn)品主要原材料的詳細(xì)依據(jù)。

1.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。

2.PCR組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

2.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；應(yīng)提交對(duì)其純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料。

2.2引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，并對(duì)序列準(zhǔn)確性、純度、穩(wěn)定性、功能性實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證。如為外購(gòu)，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

2.3探針

特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測(cè)。合成后經(jīng)PAGE或其他適宜方法純化，在5'-端（和/或3'-端）進(jìn)行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化，純度應(yīng)達(dá)到HPLC純。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜，應(yīng)對(duì)探針的分子量、純度及標(biāo)記的熒光基團(tuán)進(jìn)行核實(shí)，并進(jìn)行功能性試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.4酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時(shí)后仍保持50%活性。尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)對(duì)酶活性進(jìn)行合理驗(yàn)證。

3.核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

4.企業(yè)內(nèi)部參考品：

企業(yè)內(nèi)部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測(cè)值可溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過(guò)程、定值研究、評(píng)價(jià)指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等。建議采用滅活病毒的臨床樣本或細(xì)胞培養(yǎng)后的病毒株建立參考品，并溯源至國(guó)際參考物質(zhì)/國(guó)家參考品（如有），不宜使用質(zhì)粒。內(nèi)標(biāo)設(shè)置應(yīng)合理，陰/陽(yáng)性質(zhì)控品宜采用混合臨床樣本或病毒株或假病毒制備。試劑盒中包含的定量標(biāo)準(zhǔn)品可采用臨床樣本或病毒株、假病毒或質(zhì)粒等制備。

內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）以對(duì)管內(nèi)抑制可能造成的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)標(biāo)的引物、探針和模板的濃度做精確驗(yàn)證，保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線，不應(yīng)對(duì)目的基因的檢測(cè)造成競(jìng)爭(zhēng)性抑制而導(dǎo)致假陰性，對(duì)內(nèi)標(biāo)的Ct應(yīng)有明確的范圍要求。

陰/陽(yáng)性質(zhì)控品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。企業(yè)應(yīng)對(duì)各種質(zhì)控品的Ct做出明確的范圍要求。

企業(yè)應(yīng)提交詳細(xì)的溯源性研究資料。企業(yè)制備的企業(yè)內(nèi)部參考品、商品化校準(zhǔn)品均應(yīng)能夠溯源至國(guó)際參考物質(zhì)/國(guó)家參考品（如有）。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

基本生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過(guò)程應(yīng)對(duì)pH等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。

生產(chǎn)工藝研究的資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、校準(zhǔn)方法、質(zhì)控方法、穩(wěn)定性和有效期，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.DNA提取純化方法優(yōu)化，建議包含純化步驟，內(nèi)標(biāo)、質(zhì)控品均應(yīng)全程參與提取純化。

3.確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度、樣本量、加樣量及反應(yīng)體積等。

4.確定PCR各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。

5.對(duì)于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。

6.不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件的對(duì)比分析，如果有差異應(yīng)分別詳述。

（四）分析性能研究資料

申請(qǐng)人應(yīng)提交生產(chǎn)者在產(chǎn)品研制或成品驗(yàn)證階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，對(duì)于每項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)都應(yīng)包括具體研究目的、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)室）、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)、臨床樣本來(lái)源等。分析性能評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)方法可以參考相關(guān)的美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)批準(zhǔn)指南（CLSI-EP）文件或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行，建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。

1.EB DNA提取

病毒DNA提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，無(wú)論申報(bào)產(chǎn)品是否含有DNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對(duì)核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細(xì)的驗(yàn)證。臨床標(biāo)本中可能含有各式各樣的PCR抑制物，因此，對(duì)于DNA提取試劑的選擇，除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。目前常見(jiàn)的DNA分離純化方法和改良方法各有優(yōu)勢(shì)和不足，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合申報(bào)產(chǎn)品的特性，合理選擇DNA分離/純化試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料（提取效率、與后續(xù)試驗(yàn)的配合等）。

2.最低檢出限與定量限（分析靈敏度）

（1）最低檢出限與定量限的確定

建議使用國(guó)際參考物質(zhì)/國(guó)家參考品（如有）進(jìn)行梯度稀釋并多次檢測(cè)，并建議采用95%（n≥20）的陽(yáng)性檢出率作為最低檢測(cè)限確定的標(biāo)準(zhǔn)。

定量限應(yīng)高于或等于檢出限，將多次（至少20次）測(cè)量的結(jié)果符合試劑準(zhǔn)確度要求的最低病毒水平作為定量限。

（2）最低檢出限和定量限的驗(yàn)證

申報(bào)試劑應(yīng)在最低檢出限或接近最低檢出限、定量限的病毒濃度進(jìn)行驗(yàn)證。

企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢出限/定量限驗(yàn)證的病毒株的來(lái)源、及濃度確認(rèn)試驗(yàn)等信息。不同樣本類型（如涉及），應(yīng)分別評(píng)價(jià)最低檢出限及定量限。

3.線性范圍

線性范圍確定的研究應(yīng)使用高值臨床樣本或病毒株按一定濃度加入血液基質(zhì)中（由可溯源至國(guó)際參考物質(zhì)/國(guó)家參考品（如有）的方法定量）進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液應(yīng)使用經(jīng)確認(rèn)為陰性的混合人血液樣本，應(yīng)包含不少于9個(gè)濃度（應(yīng)包含接近最低檢測(cè)限的臨界值濃度），使用至少3個(gè)批次的試劑進(jìn)行試驗(yàn)。通過(guò)評(píng)價(jià)一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系及各水平的準(zhǔn)確度確定該產(chǎn)品的線性范圍。不同樣本類型（如涉及），應(yīng)分別評(píng)價(jià)線性范圍。

4.準(zhǔn)確度

應(yīng)使用國(guó)際參考物質(zhì)/國(guó)家參考品（如有）或企業(yè)內(nèi)部參考品和臨床樣本進(jìn)行陽(yáng)性/陰性符合率或者方法學(xué)比對(duì)研究。

5.精密度

應(yīng)對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)估重復(fù)性和重現(xiàn)性，包括運(yùn)行內(nèi)的變異和運(yùn)行間、日內(nèi)、日間、批次間、操作者間、儀器間和地點(diǎn)間的變異。

建議設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如為期12天的檢測(cè)，每天由2人完成不少于2次的完整檢測(cè)，注意應(yīng)包括核酸分離/純化步驟。可采用臨床樣本進(jìn)行試驗(yàn)，至少包含3個(gè)濃度水平：陰性樣本、略高于最低檢測(cè)限的弱陽(yáng)性樣本、中等陽(yáng)性樣本。

6.特異性

（1）交叉反應(yīng)

①用于EB DNA檢測(cè)試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀（推薦種類見(jiàn)表1）。

②建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為106 cfu/mL或更高，病毒為105 pfu/mL或更高。

③申請(qǐng)人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來(lái)源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。

*為可選驗(yàn)證的交叉反應(yīng)病原體。

（2）干擾物質(zhì)

應(yīng)針對(duì)不同樣本類型，分別評(píng)價(jià)可能存在的干擾情況。建議在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）進(jìn)行評(píng)價(jià)，并在待測(cè)物的醫(yī)學(xué)決定水平進(jìn)行檢測(cè)。潛在的干擾物質(zhì)包括內(nèi)源性、外源性和其他已報(bào)道的干擾物質(zhì)。

樣本應(yīng)至少選取全血（或血紅蛋白和白細(xì)胞）、人白蛋白、膽紅素、甘油三酯、自身抗體等進(jìn)行驗(yàn)證，并注明對(duì)被測(cè)物不產(chǎn)生干擾的最高限值。

7.其他需注意問(wèn)題

對(duì)于適用多個(gè)機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)【適用機(jī)型】項(xiàng)中所列的所有型號(hào)儀器的性能評(píng)估資料。如適用于不同樣本類型，應(yīng)提交對(duì)不同樣本類型一致性的驗(yàn)證，包括不同抗凝劑、采血管（如涉及）的驗(yàn)證。

（五）陽(yáng)性判斷值研究資料

申請(qǐng)人應(yīng)考慮不同地理區(qū)域流行病學(xué)背景以及人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征（包括性別、地域、種族等因素）的差異，選擇具有代表性的樣本建立陽(yáng)性判斷值，注意應(yīng)納入一定數(shù)量的弱陽(yáng)性樣本。如采用其他研究方法，應(yīng)說(shuō)明其合理性。

對(duì)于熒光實(shí)時(shí)PCR方法即為用于結(jié)果判讀的Ct值和/或核酸濃度的確定資料，包括確定基線閾值（threshold）、閾值循環(huán)數(shù)（Ct）、核酸濃度（如適用）的研究資料等。

另外，建議申請(qǐng)人考慮建立陽(yáng)性判斷值時(shí)使用的受試者樣本對(duì)于目標(biāo)人群的代表性，通過(guò)臨床評(píng)價(jià)進(jìn)一步驗(yàn)證和確認(rèn)陽(yáng)性判斷值的準(zhǔn)確性。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括冷藏和冷凍等條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點(diǎn)（溫度范圍），每間隔一定的時(shí)間段即對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行主要性能的分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說(shuō)明書(shū)【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】?jī)身?xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

（七）臨床評(píng)價(jià)資料

臨床試驗(yàn)的開(kāi)展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫(xiě)等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）的要求。

1.試驗(yàn)方法

對(duì)于EB病毒核酸檢測(cè)試劑而言，臨床試驗(yàn)可采用試驗(yàn)用體外診斷試劑與臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較研究試驗(yàn)，證明兩者具有等效性，從而間接證明試驗(yàn)用體外診斷試劑臨床性能能夠滿足預(yù)期用途的要求。對(duì)比試劑在預(yù)期用途、適用人群、樣本類型、檢測(cè)性能等方面應(yīng)與試驗(yàn)用體外診斷試劑具有較好的可比性。

對(duì)于比較研究試驗(yàn)中測(cè)定結(jié)果不符的樣本，應(yīng)采用臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室已建立的參考方法或者其他合理的方法（如第三方試劑、核酸序列測(cè)定方法等）進(jìn)行復(fù)核。

2.試驗(yàn)機(jī)構(gòu)

應(yīng)考慮擬申報(bào)產(chǎn)品的特點(diǎn)和預(yù)期用途，結(jié)合流行病學(xué)背景，選擇具有一定地域代表性的試驗(yàn)機(jī)構(gòu)和受試者。原則上應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測(cè)以及相關(guān)學(xué)科的優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)操作人員有足夠的時(shí)間熟悉檢測(cè)系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉評(píng)價(jià)方案。

3.試驗(yàn)方案

臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。

受試人群應(yīng)盡可能全面地代表預(yù)期適用人群。體外診斷試劑的比較研究試驗(yàn)中應(yīng)對(duì)受試者樣本設(shè)盲，并使檢測(cè)順序隨機(jī)，以避免因操作者和檢測(cè)結(jié)果的評(píng)價(jià)者知曉受試者的疾病診斷或?qū)Ρ仍噭z測(cè)結(jié)果等信息而引入偏倚。

試驗(yàn)用體外診斷試劑檢測(cè)應(yīng)與對(duì)比試劑的檢測(cè)同步進(jìn)行，以避免因疾病進(jìn)程不同或樣本采集時(shí)間不同而造成臨床試驗(yàn)結(jié)論偏離真值。不同臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)在臨床試驗(yàn)中應(yīng)盡可能統(tǒng)一試驗(yàn)操作和判讀標(biāo)準(zhǔn)等。

應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，如評(píng)價(jià)試驗(yàn)用體外診斷試劑與對(duì)比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)，并提出適合的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法。建議根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)檢測(cè)樣本的類型和數(shù)量提出要求。

4.受試者

EB病毒核酸檢測(cè)應(yīng)與臨床癥狀、體征及其他診斷方法相結(jié)合，用于EB病毒感染的輔助診斷、治療監(jiān)測(cè)等。臨床試驗(yàn)受試者應(yīng)包括各種可能接受EB病毒核酸感染檢查的人群，如原發(fā)性EB病毒感染相關(guān)疾病（傳染性單核細(xì)胞增多癥等）、慢性活動(dòng)性EB病毒感染、EB病毒感染相關(guān)的惡性腫瘤（鼻咽癌等）、免疫功能低下（器官移植患者等）或者接受免疫抑制劑治療等人群。另外，建議根據(jù)流行病學(xué)證據(jù)納入不同地區(qū)的患者/人群，以驗(yàn)證本產(chǎn)品的臨床檢出能力。

5.樣本分布

建議至少原發(fā)性EB病毒感染、慢性EB病毒感染、EB病毒感染相關(guān)的惡性腫瘤、免疫功能低下或者接受免疫抑制劑治療等人群中均應(yīng)檢測(cè)出具有EB病毒陽(yáng)性的臨床結(jié)果。

其中陽(yáng)性樣本應(yīng)包含一定數(shù)量的弱陽(yáng)性樣本或灰區(qū)樣本，并在檢測(cè)范圍內(nèi)的不同水平均有分布。在病例選擇時(shí)可考慮具有不同臨床癥狀、體征的患者等。陰性樣本主要考慮可能存在的交叉反應(yīng)情況，應(yīng)選擇其他類皰疹病毒感染患者，以從臨床角度考察其特異性。

臨床試驗(yàn)中所涉及的樣本類型應(yīng)為實(shí)際臨床檢測(cè)中常用的樣本類型。對(duì)于同時(shí)能夠檢測(cè)血清和血漿樣本的試劑，應(yīng)對(duì)同一EB病毒感染患者分別采集的血清和血漿樣本進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)研究，陽(yáng)性樣本應(yīng)包括強(qiáng)、中、弱陽(yáng)性及部分陰性樣本。臨床研究應(yīng)以前瞻性樣本為主，如采用回顧性樣本應(yīng)另行說(shuō)明 。

6.樣本量

適當(dāng)?shù)臉颖玖渴潜ＷC體外診斷試劑臨床性能得到準(zhǔn)確評(píng)價(jià)的必要條件。臨床試驗(yàn)樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行估算。根據(jù)不同的預(yù)期用途，設(shè)計(jì)相應(yīng)臨床試驗(yàn)，以輔助診斷用途為例，臨床試驗(yàn)可依據(jù)試驗(yàn)用體外診斷試劑相對(duì)于對(duì)比試劑的陰陽(yáng)性符合率分別估算最低陰陽(yáng)性樣本例數(shù)。

臨床樣本量的估算建議采用如下樣本量公式計(jì)算，

公式中，n為樣本量；Z1-α、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P0為評(píng)價(jià)指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為試驗(yàn)用體外診斷試劑評(píng)價(jià)指標(biāo)預(yù)期值。

其中，陰陽(yáng)性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于95%。獲得臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)后，證明產(chǎn)品相對(duì)于對(duì)比方法的陰陽(yáng)性符合率（置信區(qū)間下限）不低于預(yù)設(shè)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）。當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)P接近100%時(shí)，上述樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如精確概率法等。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)于本類產(chǎn)品對(duì)比實(shí)驗(yàn)的等效性研究，常用相關(guān)性、線性回歸、相關(guān)系數(shù)（r）等對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，考察兩組數(shù)據(jù)之間是否存在相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，即評(píng)價(jià)考核試劑與對(duì)比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行符合率分析，計(jì)算陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率和Kappa值等指標(biāo)及其可信區(qū)間。

8.結(jié)果不符的樣本

在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，對(duì)于兩種試劑的檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)進(jìn)行第三方復(fù)核，并結(jié)合受試者的臨床診斷信息對(duì)差異原因進(jìn)行分析，但第三方復(fù)核結(jié)果不應(yīng)納入統(tǒng)計(jì)分析。如無(wú)需復(fù)核，應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明理由。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請(qǐng)人產(chǎn)品研制、前期臨床評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的有關(guān)要求，編寫(xiě)產(chǎn)品技術(shù)要求。

如果申報(bào)試劑已有適用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品發(fā)布，則申請(qǐng)人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢驗(yàn)要求。

按照《辦法》的規(guī)定，此類產(chǎn)品為第三類體外診斷試劑。申請(qǐng)人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》的規(guī)定，以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求。附錄的編制應(yīng)符合相關(guān)編寫(xiě)規(guī)范的要求，主要原材料部分建議包括目標(biāo)物的基因位點(diǎn)區(qū)域，引物/探針的設(shè)計(jì)及來(lái)源（包括目標(biāo)物和內(nèi)對(duì)照），各種酶的來(lái)源、技術(shù)指標(biāo)和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)對(duì)照和質(zhì)控品的設(shè)置和驗(yàn)證情況等內(nèi)容。

（九）產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告

應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品技術(shù)要求，在符合《辦法》要求的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的檢驗(yàn)，提供檢驗(yàn)合格報(bào)告。

（十）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

說(shuō)明書(shū)承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，進(jìn)口體外診斷試劑的中文說(shuō)明書(shū)除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書(shū)的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

下面對(duì)EB病毒核酸檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

1.【預(yù)期用途】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

1.1試劑盒用于定量檢測(cè)人體樣本（如全血、血漿、血清等）中的EB DNA，適用樣本類型應(yīng)依據(jù)申報(bào)產(chǎn)品的分析性能評(píng)估和臨床研究情況進(jìn)行確認(rèn)。

1.2目標(biāo)物的特征：簡(jiǎn)要描述病原體生物學(xué)特征及致病性，感染后臨床表現(xiàn)，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法等。

1.3目標(biāo)人群：各種可能接受EB病毒核酸感染檢查的人群。例如原發(fā)性EB病毒感染、慢性EB病毒感染、EB病毒感染相關(guān)的惡性腫瘤、免疫功能低下或者接受免疫抑制劑治療等人群。注：未對(duì)上述目標(biāo)人群進(jìn)行相關(guān)臨床研究的產(chǎn)品應(yīng)在此項(xiàng)下聲明：由于未做相關(guān)驗(yàn)證，本產(chǎn)品不能用于相關(guān)臨床預(yù)期人群。

1.4產(chǎn)品功能：結(jié)合目標(biāo)人群的臨床表現(xiàn)和其他診斷指標(biāo)，可用于EB病毒感染的輔助診斷、治療監(jiān)測(cè)等。

2.【檢驗(yàn)原理】

2.1 描述試劑盒檢測(cè)能夠覆蓋的目標(biāo)基因序列特征，引物及探針的設(shè)計(jì)，反應(yīng)體系（管）組合形式，內(nèi)對(duì)照和質(zhì)控品的設(shè)置及熒光信號(hào)標(biāo)記等。

2.2 描述核酸提取純化的方法、原理等。

2.3 描述試劑盒的技術(shù)原理，可結(jié)合圖示進(jìn)行說(shuō)明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶），也應(yīng)介紹其作用機(jī)理。

3.【主要組成成分】

3.1詳細(xì)說(shuō)明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質(zhì)，應(yīng)說(shuō)明其生物學(xué)來(lái)源、活性及其他特性；說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2 如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，應(yīng)在此明確經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、注冊(cè)證號(hào)（如有）以及配合使用的儀器等信息。

3.3試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必需的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及備案憑證號(hào)或注冊(cè)證號(hào)（如有）等信息。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

說(shuō)明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開(kāi)封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)標(biāo)明具體的儲(chǔ)存條件及效期。

5.【適用機(jī)型】

注明所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6.【樣本要求】

6.1樣本收集要求：結(jié)合臨床公認(rèn)推薦的采樣要求。

6.2血液樣本應(yīng)當(dāng)說(shuō)明對(duì)采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、采血管和抗凝劑，其他樣本應(yīng)說(shuō)明樣本采集、處理及保存方式。

6.3樣本處理、運(yùn)送及保存：對(duì)血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預(yù)處理、運(yùn)送條件、保存條件及期限（短期、長(zhǎng)期）等。冷藏/冷凍樣本檢測(cè)前是否需恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的要求。如有需要應(yīng)對(duì)高于檢測(cè)范圍的樣本稀釋方法進(jìn)行規(guī)定。

7.【檢驗(yàn)方法】

描述自動(dòng)分析的工作流程或者詳細(xì)說(shuō)明試驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，例如：

7.1試劑準(zhǔn)備及配制方法、注意事項(xiàng)。

7.2詳細(xì)描述待測(cè)樣本、質(zhì)控品的核酸提取/純化方法，包括條件、步驟及注意事項(xiàng)。

7.3擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.4 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)設(shè)置及注意事項(xiàng)。

7.5儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況設(shè)置目標(biāo)基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道。

7.6基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。

7.7質(zhì)量控制方法：試劑盒內(nèi)陰/陽(yáng)性質(zhì)控品、內(nèi)標(biāo)的Ct值范圍要求。

8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）以及目標(biāo)基因的檢測(cè)結(jié)果，以列表形式詳細(xì)描述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋，可用Ct值表示。如存在灰區(qū)，應(yīng)同時(shí)說(shuō)明對(duì)灰區(qū)結(jié)果的處理方式，包括在何種情況下需要進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，重復(fù)檢測(cè)的方法，對(duì)樣本可能采取的優(yōu)化條件（如采集要求或采集方法）等。如適用，也可結(jié)合擴(kuò)增結(jié)果的S形曲線對(duì)灰區(qū)結(jié)果進(jìn)行判定。

9.【檢驗(yàn)方法局限性】

9.1本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者的癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果等情況進(jìn)行綜合分析以及解釋，不得作為患者臨床診治或管理的唯一依據(jù)。

9.2導(dǎo)致假陰性/假陽(yáng)性結(jié)果的可能性分析：

9.2.1不合理的樣本采集、處理、運(yùn)輸及保存條件，樣本中目標(biāo)物滴度過(guò)低。

9.2.2EB病毒核酸目標(biāo)基因序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖儭?/p>

9.2.3同一患者不同時(shí)間、不同部位或者多次采集樣本會(huì)降低假陰性結(jié)果的可能性。

9.2.4未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾，如內(nèi)源性或外源引入樣本的物質(zhì)。

9.2.5樣本間的交叉污染。

9.2.6未經(jīng)驗(yàn)證的其他交叉反應(yīng)物質(zhì)。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】詳述以下性能指標(biāo)：

10.1最低檢出限及定量限：說(shuō)明試劑不同樣本類型的最低檢出濃度和最低定量濃度，簡(jiǎn)單介紹最低檢出限/定量限的確定及驗(yàn)證方法。

10.2線性范圍：確定線性范圍的方法、濃度范圍、相關(guān)系數(shù)等信息。

10.3精密度：說(shuō)明不同類型樣本的重復(fù)性和重現(xiàn)性評(píng)價(jià)結(jié)果。

10.4分析特異性：包括交叉反應(yīng)和干擾物質(zhì)

10.4.1可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的驗(yàn)證情況，建議以列表的方式描述病原體名稱、型別、濃度等信息。

10.4.2樣本中常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，應(yīng)注明可接受的最高限值。

10.5臨床試驗(yàn)：簡(jiǎn)要介紹試驗(yàn)方法、受試者及樣本、試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論等。

11.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

（1）有關(guān)人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)校準(zhǔn)品、質(zhì)控品或其他可能含有人源物質(zhì)的組分，雖已通過(guò)乙型肝炎表面抗原（HbsAg）、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV1/2）、丙型肝炎抗體（抗-HCV）等項(xiàng)目的檢測(cè)為陰性，但截至目前，沒(méi)有任何一項(xiàng)檢測(cè)可以確保絕對(duì)安全，故仍應(yīng)將這些組分作為潛在傳染源對(duì)待。

（2）臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》配備設(shè)備及操作人員，應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。

三、參考文獻(xiàn)

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2.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則，2014年9月.

3.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則，2014年9月.

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5.全國(guó)兒童EB病毒感染協(xié)作組.EB病毒感染實(shí)驗(yàn)室診斷及臨床應(yīng)用專家共識(shí). 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2018.2（32）：2-8.

6.中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會(huì)鼻咽癌標(biāo)志物專家委員會(huì).鼻咽癌標(biāo)志物臨床應(yīng)用專家共識(shí).中國(guó)癌癥防治雜志，2011.6（11） ：183-193.

四、起草單位

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。