附件：人表皮生長因子受體2基因擴增檢測試劑盒（熒光原位雜交法）注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2017年第209號）.doc

人表皮生長因子受體2基因擴增檢測試劑盒（熒光原位雜交法）注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對人表皮生長因子受體2基因擴增檢測試劑盒（熒光原位雜交法）注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導(dǎo)原則是對人表皮生長因子受體2基因擴增檢測試劑盒（熒光原位雜交法）的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導(dǎo)原則是供申請人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)、標準的不斷完善和科學技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、范圍

人表皮生長因子受體2（Human Epidermal growth factor Receptor 2，HER2）基因定位于染色體17q12，是表皮生長因子受體（EGFR）的成員之一，HER2基因編碼分子量為185kDa的酪氨酸激酶活性跨膜糖蛋白。HER2蛋白主要通過與家族中其他成員形成異二聚體而與各自的配體結(jié)合；當異二聚體與配體結(jié)合后，激活酪氨酸激酶的活性。參與細胞的增殖、凋亡調(diào)控、血管和淋巴管新生等生物學功能。HER2蛋白的過表達主要是由于HER2基因的擴增，可導(dǎo)致腫瘤細胞內(nèi)信號通路的異?；罨?，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。HER2基因的擴增和蛋白的過表達均可稱為HER2陽性，該情況出現(xiàn)于部分原發(fā)性浸潤性乳腺癌、胃及胃和食管交界處癌（以下統(tǒng)稱胃癌）等患者中。

對于浸潤性乳腺癌適應(yīng)癥，HER2陽性是指免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）檢測結(jié)果為（3+），或原位雜交方法（In situ Hybridization，ISH）檢測結(jié)果為基因擴增。而IHC檢測結(jié)果為（2+）的病例為不確定，需進一步應(yīng)用原位雜交方法進行HER2擴增狀態(tài)的檢測。對于胃癌適應(yīng)癥，HER2陽性是指IHC檢測結(jié)果為HER2（2+）的同時ISH檢測結(jié)果為基因擴增，或IHC檢測結(jié)果為HER2（3+）。

對HER2陽性的乳腺癌和胃癌患者進行聯(lián)合抗HER2靶向治療（如抗HER2單克隆抗體、小分子酪氨酸激酶抑制劑等）使得部分患者的生存狀況得到改善，但是在HER2陰性的患者中沒有效果。準確地檢測HER2蛋白表達和基因擴增狀態(tài)是抗HER2單克隆抗體分子靶向治療患者篩選和療效預(yù)測的前提，對乳腺癌和胃癌的臨床治療和/或預(yù)后判斷至關(guān)重要。對于浸潤性乳腺癌適應(yīng)癥，HER2是患者重要的預(yù)后指標，也是抗HER2藥物治療的主要預(yù)測指標。對于胃癌適應(yīng)癥，HER2是晚期胃癌的療效預(yù)測標志物。

本指導(dǎo)原則適用于采用熒光原位雜交方法檢測手術(shù)切除樣本和活檢樣本的組織切片中的HER2基因擴增情況，包括HER2基因平均拷貝數(shù)（單信號）、HER2基因平均拷貝數(shù)和該基因所在的第17號染色體著絲粒（CEP17）序列平均拷貝數(shù)的比值（雙信號）。對于其他應(yīng)用亮視野原位雜交法檢測HER2基因擴增水平的方法，如顯色原位雜交法（Chromogenic In Situ Hybridization，CISH）和銀增強原位雜交法（Silver—enhanced In Situ Hybridization，SISH），可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進行修訂或補充其他的評價和驗證資料，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。

本指導(dǎo)原則適用于進行首次注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。其他未盡事宜（包括產(chǎn)品風險分析資料等），應(yīng)當符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號，以下簡稱《辦法》）等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料的撰寫應(yīng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）（以下簡稱2014年第44號公告）的相關(guān)要求。內(nèi)容主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價以及同類產(chǎn)品在國內(nèi)外批準上市的情況介紹等內(nèi)容。重點內(nèi)容要求如下：

1.預(yù)期用途：HER2基因及其家族簡介，在相關(guān)適應(yīng)癥中的表達情況，與組織病理學特征的關(guān)系，其擴增情況與乳腺癌和胃癌治療方案制定以及預(yù)后判斷的關(guān)系等。

2.產(chǎn)品描述：熒光原位雜交法（Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）的技術(shù)原理，目標基因的座位區(qū)域，探針的設(shè)計原則以及標記的熒光染料，細胞核復(fù)染方式，以及結(jié)果判讀標準和統(tǒng)計方式等。

3.同類產(chǎn)品上市情況：與相同或相似方法學（如IHC、其他原位雜交方法等）的產(chǎn)品在性能、上市情況和結(jié)果判讀等方面的比較。

（二）主要原材料研究資料

申請人應(yīng)驗證主要原材料的性能指標符合產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)和檢驗要求，以確定設(shè)計要求或者外購廠家，并制定主要原材料的質(zhì)量標準。

1.探針：根據(jù)不同用途，分為基因特異性探針（HER2）和著絲粒探針（CEP17）兩種類型。探針可選擇細菌人工染色體（BAC）克隆或者聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）等方法進行制備。下述內(nèi)容是對于探針制備通用要求的舉例，如有其他替代方法，應(yīng)詳細闡述其科學合理性。

1.1基因特異性探針

1.1.1探針序列的確定：包括探針所在基因的位置區(qū)域，人類基因組文庫的篩選、比對和特征確認過程。

1.1.2人類基因組文庫克隆的鑒定：一般檢測與基因區(qū)域相關(guān)的序列標記位點（STS）的存在情況，包括引物的設(shè)計，PCR過程和產(chǎn)物的電泳圖譜。

1.1.3探針的標記：一般為酶促反應(yīng)或者化學合成方法，應(yīng)詳述標記方式的選擇、反應(yīng)體系和過程、產(chǎn)物的純化方式等。

1.2著絲粒探針：包括微衛(wèi)星重復(fù)單元的序列，PCR引物的設(shè)計和選擇，熒光染料標記的反應(yīng)體系、過程和產(chǎn)物的純化方式等。

1.3探針的質(zhì)量控制：性能指標一般包括濃度、純度、Tm值（如適用）、雜交效率、特異性等，可使用測定260nm處紫外吸收峰值、測定260nm與280nm處紫外吸收峰值的比值、瓊脂糖凝膠電泳、染色體分散良好的中期相分裂細胞雜交驗證等方式。

2.熒光染料：技術(shù)指標包括最大發(fā)射/吸收峰，與目的核酸片段的結(jié)合能力，持續(xù)被激發(fā)光源照射時的抗淬滅能力等。

3.雜交緩沖液：應(yīng)描述組成配方，說明各成分的作用。質(zhì)量標準應(yīng)包括pH值、鹽離子濃度、甲酰胺濃度、硫酸葡聚糖濃度等。

4.人Cot-1 DNA（如適用）：是由大量人類基因組重復(fù)序列組成的高濃度DNA，能封閉樣品中的DNA重復(fù)序列，降低檢測背景。要求能有效封閉背景信號，避免由于非特異性雜交而影響檢測結(jié)果的判讀。應(yīng)評價人Cot-1 DNA對樣本檢測背景信號的封閉效果，方法可選擇通過觀察背景強度以及非特異雜交的強度而確定人 Cot-1 DNA的用量。如有其他清除背景信號的方法，應(yīng)充分說明其科學合理性。

5.二脒基苯基吲哚（DAPI）復(fù)染劑：評價指標包括對細胞核的染色能力以及抗淬滅能力等。

6.企業(yè)參考品：應(yīng)包含陰性參考品、陽性參考品和特異性參考品，并詳細說明參考品的來源、組成、制備和保存情況。陽性參考品可選擇經(jīng)已上市產(chǎn)品確認HER2基因擴增的乳腺浸潤癌/胃癌組織，或者人乳腺癌/胃癌細胞株。陰性參考品可選擇經(jīng)已上市產(chǎn)品確認HER2基因無擴增的腫瘤組織，或者腫瘤細胞株。特異性參考品可選擇健康人外周血培養(yǎng)細胞，應(yīng)含有較多染色體分散良好的中期分裂相淋巴細胞。

7.質(zhì)控片（如有）：可作為試劑盒的組分或者單獨配置，包含陰性質(zhì)控片、臨界值質(zhì)控片和/或陽性質(zhì)控片?？蛇x擇臨床組織樣本或者HER2擴增狀態(tài)確定的細胞株。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

申請人應(yīng)描述主要生產(chǎn)工藝及確定依據(jù)，詳述工序流程以及各個步驟的質(zhì)量關(guān)鍵控制點。

申請人應(yīng)建立適當?shù)姆磻?yīng)體系，以平衡最佳檢測信號和背景強度的關(guān)系。反應(yīng)過程包括樣本預(yù)處理和雜交檢測兩個步驟，其中樣本預(yù)處理過程一般包括樣本脫蠟、樣本預(yù)處理、蛋白酶處理三個環(huán)節(jié)，雜交檢測過程一般包括變性、雜交、雜交后洗滌、DAPI復(fù)染四個環(huán)節(jié)。另外，應(yīng)合理控制樣本的質(zhì)量并明確要求。

1.樣本的采集、固定、制片、保存和運輸：應(yīng)對采樣部位及方法、樣本中腫瘤組織的含量、離體到固定的溫度及時間、固定溫度及時間、保存和運輸?shù)臈l件和時間進行研究或者驗證，結(jié)合組織形態(tài)及病理學特征，保證樣本的準確性以及其中DNA的完整性。另外，切片質(zhì)量對檢測結(jié)果的判讀十分重要，應(yīng)對切片厚度進行研究或者驗證，要求計數(shù)區(qū)域的細胞胞核邊界完整、DAPI染色均一、細胞核無重疊、熒光信號清晰。不同類型的樣本應(yīng)分別驗證。具體可參考國際或國內(nèi)相關(guān)標準操作規(guī)程；如與標準操作規(guī)程有差異，應(yīng)進行充分研究。

2.樣本預(yù)處理：應(yīng)對脫蠟條件、預(yù)處理溫度及時間、特定鹽溶液的離子強度、蛋白酶的消化條件進行充分研究，以避免處理過程中組織和DNA的損失造成檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。如其中預(yù)處理過程可選擇多個溫度/時間的組合，蛋白酶消化過程可選擇多個持續(xù)時間進行研究。溫度/時間的組合是指首先在同一時期的幾個不同溫度下進行，然后在優(yōu)化溫度條件下的幾個不同持續(xù)時間進行。

3.樣本變性條件：應(yīng)對樣本變性處理的溫度、持續(xù)時間的組合進行充分研究，以保證樣本中DNA雙鏈的充分解鏈，有利于后續(xù)探針和樣本的結(jié)合，提高雜交效率以及保證雜交的特異性。如選擇多個溫度/時間的組合進行研究。

4.樣本雜交條件：應(yīng)對樣本雜交步驟的溫度、持續(xù)時間的組合進行充分研究，以達到探針和樣本的最佳結(jié)合效率。如選擇多個溫度/時間的組合進行研究。

5.雜交后洗滌條件：應(yīng)對緩沖液的鹽濃度和去垢劑成分，以及清洗溫度、時間、次數(shù)的組合進行充分研究，以達到最佳的雜交嚴格度。要求盡可能去除樣本中的核蛋白等干擾物質(zhì)，避免非特異性雜交，降低背景干擾，并且增加目標信號的強度。如選擇多個緩沖液濃度以及多個清洗條件的組合進行研究。

（四）分析性能評估資料

申請人應(yīng)使用多批產(chǎn)品進行研究，建立穩(wěn)定可靠的性能指標。需提交在產(chǎn)品研制和成品驗證階段對試劑盒進行的所有性能評價的研究資料，包括方案設(shè)計、研究方法、材料和設(shè)備、驗收標準、試驗數(shù)據(jù)（包括代表性彩色圖片）和結(jié)果統(tǒng)計分析等詳細資料。建議著重對以下性能指標進行研究：

1.靈敏度

主要反映產(chǎn)品檢測時探針與目標基因位點的結(jié)合效率，也稱為雜交效率。由于組織固定時蛋白質(zhì)和核酸產(chǎn)生的分子間交聯(lián)等對靶核酸具有屏蔽作用，探針穿透細胞的能力不同，導(dǎo)致產(chǎn)品對于不同類型樣本的雜交效率存在性能差異；應(yīng)使用臨床應(yīng)用環(huán)境中所有可能的樣本類型中具有代表性的類型進行評估。方法可選擇20個乳腺浸潤癌/胃癌病例的組織樣本，以及20個癌旁正常組織或者良性疾病組織樣本；對同樣數(shù)量的細胞隨機進行分析計數(shù)。每例組織樣本應(yīng)至少檢測20個細胞，分析統(tǒng)計HER2基因熒光信號數(shù)量，或者同時顯示HER2基因位點標記和第17號染色體著絲粒（CEP17）位點標記的熒光信號的細胞占全部細胞的比例。

2.特異性

主要反映HER2和CEP17探針對目標序列識別的特異性。建議使用中期分裂相的外周血淋巴細胞進行涂片分析。選擇5份以上正常人的外周血培養(yǎng)細胞涂片樣本，每例樣本應(yīng)至少檢測20個染色體分散良好的中期分裂相細胞，對至少200個靶位點進行分析計數(shù)；結(jié)合染色體G顯帶分析，統(tǒng)計細胞核染色體上正確位點的雜交信號占全部雜交信號的比例。應(yīng)使用標準的細胞遺傳學技術(shù)識別信號位點，例如染色體形態(tài)學分析、染色體區(qū)段染色、反向DAPI條帶等技術(shù)；考察在HER2基因位點（17q11.2-q12）和/或第17號染色體著絲粒位點（17q11.2-q11.1）的特定熒光信號占全部熒光信號的比例。

3.陰、陽性符合率

主要反映產(chǎn)品對不同類型樣本中HER2基因的檢出能力和準確性。應(yīng)使用臨床應(yīng)用環(huán)境中所有可能的樣本類型中具有代表性的組織類型進行評價，并提供樣本來源、唯一可溯源編號、病理組織類型，以及明確的HER2基因擴增狀態(tài)。對于適應(yīng)癥為乳腺癌的情況，用于評價的樣本類型應(yīng)包括乳腺浸潤性癌非特殊類型、乳腺浸潤性小葉癌、小管癌、粘液癌，良性疾病（如腺病及纖維腺瘤）以及正常乳腺組織等。對于適應(yīng)癥為胃癌的情況，用于評價的樣本類型應(yīng)包括腸型、彌漫型、混合型（Lauren分型）胃癌，良性疾?。ㄈ缥刚衬ぢ匝装Y）以及正常胃組織等。每種組織類型設(shè)置2至3例樣本進行評價。建議著重評價申報產(chǎn)品對IHC檢測結(jié)果為HER2（2+）樣本的HER2基因擴增狀態(tài)的檢測能力。

4.精密度

申請人應(yīng)充分考慮到配套檢測系統(tǒng)以及使用環(huán)境的因素：包括熒光顯微鏡的特征、激發(fā)光源及過濾器的性能參數(shù)、物鏡放大倍數(shù)等，以及不同時間、地點、操作人員、檢測次數(shù)對結(jié)果判讀的影響；對可能導(dǎo)致檢測之間差異的主要變量進行驗證。用于精密度評價的參考品應(yīng)選擇HER2擴增、HER2無擴增以及臨界值的連續(xù)切片組織樣本。其中臨界值樣本和成簇擴增的樣本應(yīng)分別設(shè)置驗收標準（標準差以及變異系數(shù)的范圍）。建議參考下述方法進行各個指標的評價：

4.1批內(nèi)精密度：由同一操作人員使用同一批次產(chǎn)品進行檢測，每例樣本重復(fù)檢測多次，對結(jié)果判讀的一致性進行統(tǒng)計分析。

4.2批間精密度：由同一操作人員使用多個批次產(chǎn)品進行檢測，每例樣本重復(fù)檢測多次，對結(jié)果判讀的一致性進行分析統(tǒng)計。

4.3日間精密度：在多個不同日期，由同一操作人員使用同一批次產(chǎn)品進行檢測，對結(jié)果判讀的一致性進行統(tǒng)計分析。

4.4人員間精密度：由數(shù)位操作人員使用同一批次產(chǎn)品進行檢測，每份樣本由數(shù)位閱片人員進行獨立結(jié)果判讀。對不同操作人員/閱片人員對同一例組織樣本檢驗方法以及結(jié)果判讀的一致性進行分析統(tǒng)計。

4.5室間精密度：建議申請人選擇不同的實驗室進行檢測間一致性的評價。

（五）陽性判斷值確定資料

HER2檢測結(jié)果的判讀標準不斷進行著更新，申請人應(yīng)參考最新版臨床指南性文件建立陽性判斷值。應(yīng)提交申報產(chǎn)品判讀規(guī)則以及預(yù)設(shè)陽性判斷值所依據(jù)的文獻資料，并采用具有統(tǒng)計學意義數(shù)量的樣本對判讀規(guī)則以及預(yù)設(shè)陽性判斷值進行驗證。應(yīng)包含HER2擴增、HER2無擴增以及一定數(shù)量的臨界值（陽性判斷值附近）組織樣本，包括HER2/CEP17熒光信號總數(shù)比值在2附近（1.8～2.2），或者每個細胞的平均HER2拷貝數(shù)在4～6附近的樣本。

首先設(shè)定檢測結(jié)果重復(fù)性較好的目標，即HER2平均拷貝數(shù)或者HER2平均拷貝數(shù)/CEP17平均拷貝數(shù)的標準差/變異系數(shù)范圍驗收標準，確定初始統(tǒng)計細胞區(qū)域和數(shù)量，并在結(jié)果不確定時納入更多區(qū)域或數(shù)量進行統(tǒng)計。

然后建議參照組織病理學特征或者IHC結(jié)果確定可能存在擴增的浸潤性乳腺癌/胃癌區(qū)域，選擇細胞核大小一致、胞核邊界完整、DAPI染色均一、細胞核無重疊、熒光信號清晰的細胞，隨機計數(shù)2個區(qū)域中的至少20個細胞，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

（六）穩(wěn)定性研究資料

根據(jù)本產(chǎn)品特性，申請人應(yīng)分別從實時穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、開瓶/凍融穩(wěn)定性，以及使用過程中的雜交后信號穩(wěn)定性、探針的光照穩(wěn)定性等方面對產(chǎn)品的穩(wěn)定性進行研究，充分考慮在實際的運輸、保存和使用條件下對產(chǎn)品性能的影響。其中使用過程穩(wěn)定性應(yīng)評價在實際使用的實驗室環(huán)境條件下，不同的光照條件對熒光標記探針以及雜交后樣本熒光信號強度的影響，注意應(yīng)覆蓋檢測的全過程。評價指標應(yīng)至少包括靈敏度、特異性以及熒光信號強度。

樣本中核酸的完整性對于結(jié)果的正確判讀也十分關(guān)鍵。申請人應(yīng)充分考慮臨床樣本采集、處理、運輸、儲存與切片制備等各個階段的條件，如溫度、濕度對樣本質(zhì)量的影響，全面評價臨床樣本、質(zhì)控品和企業(yè)參考品的穩(wěn)定性。樣本穩(wěn)定性應(yīng)分別評價石蠟包埋組織塊與組織切片的穩(wěn)定性，評價指標應(yīng)至少包括儲存溫度及時間。

（七）臨床評價資料

臨床試驗總體要求及臨床試驗資料的內(nèi)容應(yīng)符合《辦法》、2014年第44號公告和《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的規(guī)定，以下僅結(jié)合人表皮生長因子受體2基因擴增檢測試劑盒（熒光原位雜交法）的具體特點對其臨床試驗中應(yīng)重點關(guān)注的內(nèi)容進行闡述。

1.臨床試驗機構(gòu)及人員的要求

申請人應(yīng)當選定不少于3家（含3家）已備案的醫(yī)療器械臨床試驗機構(gòu)，按照有關(guān)規(guī)定開展臨床試驗。申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點及其預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種、流行病學背景等因素選擇臨床試驗機構(gòu)。臨床試驗機構(gòu)必須具有與申報試劑相適應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員及儀器設(shè)備，并能夠確保該項試驗的實施。

2.試驗方案

2.1各臨床試驗機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床試驗機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，需強調(diào)組織標本的標準采樣、及時在10%中性緩沖福爾馬林溶液中充分固定及其他標準操作程序。申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

2.2以圖表的形式對試驗總體設(shè)計及工作流程進行描述，圖表中應(yīng)包括連續(xù)切片的數(shù)量及用途分配等。各臨床試驗機構(gòu)選用的對比試劑應(yīng)保持一致，以便進行合理的統(tǒng)計學分析。

2.3試驗方案中應(yīng)確定嚴格的病例納入/排除選擇標準，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床試驗都應(yīng)記錄在案，并明確說明原因。

2.4試驗方案中應(yīng)明確閱片者、操作者的選擇標準。閱片者應(yīng)選擇在免疫組織化學、熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用和乳腺癌/胃癌病理診斷中有豐富經(jīng)驗的醫(yī)學工作者。

2.5在試驗操作過程中和判定檢測結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。臨床試驗研究方案中應(yīng)詳述盲法的具體操作流程。

2.6臨床試驗前申請人應(yīng)對臨床試驗機構(gòu)參與人員進行相關(guān)技術(shù)培訓(xùn)，并采用統(tǒng)一判讀標準，保持各臨床試驗機構(gòu)的判讀一致性。注意判讀方法與說明書要求一致。

2.7在整個試驗中，試驗用體外診斷試劑和對比試劑都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準確性及可重復(fù)性。臨床試驗研究方案中應(yīng)明確質(zhì)控方法及配合用質(zhì)控試劑的詳細信息。

3.試驗方法

3.1“已有同品種批準上市”產(chǎn)品

應(yīng)選擇已批準上市，且已經(jīng)充分聯(lián)合藥物進行臨床評價的伴隨診斷試劑作為對比試劑，證明本品與已上市產(chǎn)品等效。

3.2新產(chǎn)品

用于胃癌等其他用途的此類檢測試劑，如無已上市同類產(chǎn)品，應(yīng)選擇臨床試驗機構(gòu)已建立的參考方法（應(yīng)可報告腫瘤細胞HER2基因平均拷貝數(shù)和腫瘤細胞CEP17平均拷貝數(shù)）為參比方法，進行檢測結(jié)果的一致性研究。該參考方法應(yīng)已經(jīng)充分聯(lián)合藥物進行臨床評價。

3.3對于預(yù)期用途中已明確配合具體治療藥物名稱的檢測試劑，應(yīng)采用聯(lián)合藥物評價臨床試驗的形式，同時評價檢測結(jié)果與接受靶向治療藥物后療效的相關(guān)性和試驗用體外診斷試劑檢測的準確性。

3.4臨床試驗用樣本的選擇和樣本量

臨床試驗應(yīng)選擇經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣本或組織芯片。

應(yīng)根據(jù)設(shè)定的符合率接受標準和選定的統(tǒng)計學方法分別計算總樣本例數(shù)及IHC檢測結(jié)果為HER2（2+）的樣本例數(shù)。但總樣本例數(shù)不低于1000例。其中IHC檢測結(jié)果為HER2（2+）的樣本不少于400例。如申報試劑聲稱可以用于檢測兩種或兩種以上腫瘤類型，則應(yīng)在一種類型滿足上述要求的基礎(chǔ)上，對每種新增的腫瘤類型進行不少于300例樣本的臨床驗證，IHC檢測結(jié)果為HER2（2+）的樣本不少于120例。樣本的選擇應(yīng)包含臨床預(yù)期使用人群和特異性樣本，注意包含臨床相關(guān)的各種病理組織類型。

對于適應(yīng)癥為浸潤性乳腺癌的情況，樣本應(yīng)包含臨床常見的各種浸潤性乳腺癌病理組織類型，如乳腺浸潤性癌非特殊類型、乳腺浸潤性小葉癌、小管癌、粘液癌。特異性樣本應(yīng)包含腺病及纖維腺瘤。

對于適應(yīng)癥為胃癌的情況，樣本應(yīng)包含臨床常見的各種腺癌病理組織類型，如腸型、彌漫型、混合型（Lauren分型）。特異性樣本應(yīng)包含胃粘膜慢性炎。

4.統(tǒng)計學分析

4.1對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法。

4.1.1對于本類試劑，常以配對列聯(lián)表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，分別計算全部樣本的陽性符合率、陰性符合率和總符合率以及IHC檢測結(jié)果為HER2（2+）樣本的陽性符合率、陰性符合率和總符合率。應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計學檢驗或推斷方法（如95%置信區(qū)間），給出不確定樣本占全部樣本的比例，并評價其對符合率的影響，以檢驗兩種試劑檢測結(jié)果的一致性。

4.1.2由于此類試劑在臨床結(jié)果的報告中同時報告腫瘤細胞HER2基因平均拷貝數(shù)、腫瘤細胞CEP17平均拷貝數(shù)（雙探針適用）和兩者的比值（雙探針適用），因此還應(yīng)對拷貝數(shù)的準確性進行評價?？刹捎迷囼炗皿w外診斷試劑（考核試劑）與對比試劑或參考方法檢測結(jié)果的腫瘤細胞HER2基因平均拷貝數(shù)和腫瘤細胞CEP17平均拷貝數(shù)（雙探針適用）做散點圖的方法，配合適當?shù)慕y(tǒng)計分析方法，如以線性回歸為基礎(chǔ)的分析方法或Bland-Altman方法等，評價考核試劑與對比試劑對于腫瘤細胞HER2基因平均拷貝數(shù)和腫瘤細胞CEP17平均拷貝數(shù)（雙探針適用）檢測結(jié)果的一致性。

4.2對臨床試驗中人群基本特征進行分析，包括：年齡、性別、病理組織類型、癌癥分期情況、免疫組織化學檢測結(jié)果等（見表1）。

4.3聯(lián)合藥物評價臨床試驗部分

可采用前瞻性或回顧性研究方法，結(jié)合接受藥物治療后的臨床試驗數(shù)據(jù)等，分析檢測結(jié)果。此部分研究通常使用Kaplan Meier曲線等生存數(shù)據(jù)分析方法，選取適當?shù)慕y(tǒng)計方法檢驗客觀有效率，評價檢測結(jié)果與用藥后臨床結(jié)局之間的相關(guān)性。樣本數(shù)量應(yīng)符合統(tǒng)計學要求。

5.結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用第三方試劑或其他合理的方法進行復(fù)核，同時結(jié)合組織病理學特征、免疫組織化學檢測結(jié)果等對差異產(chǎn)生原因進行分析。

6.質(zhì)量控制

由于檢測前預(yù)處理步驟較多，導(dǎo)致判讀結(jié)果可能會在試驗人員間、實驗室間產(chǎn)生差異。為了客觀單一評價試劑性能，盡量減少這種人為差異對最終結(jié)果造成的影響，臨床試驗開始前，各臨床試驗機構(gòu)應(yīng)統(tǒng)一操作方法，進行判讀一致性訓(xùn)練及統(tǒng)一的質(zhì)量控制，確保同樣的樣本在不同機構(gòu)之間的判讀結(jié)果保持一致。注意應(yīng)包含IHC以及FISH檢測結(jié)果為陰性、陽性和不確定的樣本。該預(yù)評估內(nèi)容、實現(xiàn)方法、結(jié)果等應(yīng)在臨床試驗報告中體現(xiàn)。

7.原始數(shù)據(jù)

7.1提交病例報告表（Case Report Form，CRF），內(nèi)容應(yīng)至少包括：性別、年齡、標本的采集部位、標本類型、病理診斷結(jié)果（包含分級）、HE染色結(jié)果、免疫組織化學檢測結(jié)果、考核試劑檢測結(jié)果、對比試劑檢測結(jié)果、第三方復(fù)核結(jié)果。所有采用原位雜交法的檢測結(jié)果均應(yīng)包含評估的細胞數(shù)量、HER2基因/CEP17熒光信號比值（雙探針適用）、每個細胞的平均HER2拷貝數(shù)、每個細胞的平均CEP17拷貝數(shù)（雙探針適用）和定性判讀結(jié)果。

7.2提交入選樣本結(jié)果的代表性彩色圖片。

8.臨床試驗總結(jié)報告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗報告應(yīng)對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床試驗總結(jié)報告中對以下內(nèi)容進行詳述：

8.1臨床試驗總體設(shè)計及方案描述

8.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床試驗機構(gòu)選擇、臨床主要試驗人員的選擇、人員簡介等基本情況介紹；

8.1.2病例納入/排除標準、標本的選擇例數(shù)及標準；

8.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等；

8.1.4陰、陽性判讀標準、統(tǒng)計學方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標準及樣本量確定依據(jù)。

8.2臨床試驗具體情況

8.2.1試驗用體外診斷試劑和對比試劑的名稱、批號、有效期等信息；

8.2.2對各臨床試驗機構(gòu)的病例數(shù)、人群分布情況進行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比；

8.2.3質(zhì)量控制，試驗人員培訓(xùn)、質(zhì)控片的檢測情況，對檢測結(jié)果判讀的抽查結(jié)果評估；

8.2.4具體試驗過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本保存、結(jié)果不一致樣本的驗證等。

8.3臨床試驗結(jié)果及分析

8.3.1數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異結(jié)果的重新檢測或采用其他合理的方法進行復(fù)核及無法評估樣本的處理、試驗過程中是否涉及對方案的修改。

8.3.2結(jié)果的一致性分析

計算陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。采用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法，對定性結(jié)果的檢測一致性和拷貝數(shù)檢測一致性進行評價。采用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法對聯(lián)合藥物臨床評價部分數(shù)據(jù)進行分析評價，研究檢測結(jié)果與用藥后臨床結(jié)局之間的相關(guān)性（如適用）。

8.4討論和結(jié)論

對整體結(jié)果進行總結(jié)性描述并簡要分析試驗結(jié)果，對本次臨床試驗的特別說明（如有），最后得出臨床試驗結(jié)論。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請人應(yīng)當在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、臨床評價等結(jié)果，依據(jù)國家標準、行業(yè)標準及相關(guān)文獻，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。需符合《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的要求。

產(chǎn)品性能指標主要包括：外觀、熒光信號強度、靈敏度、特異性、陽性符合率、陰性符合率等。如果申報試劑已有適用的國家參考品/標準品發(fā)布，則申請人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢測要求。另外，產(chǎn)品技術(shù)要求中應(yīng)以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求，需符合相關(guān)編寫規(guī)范的要求。

（九）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、檢測方法及檢測結(jié)果解釋等重要信息，是指導(dǎo)實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢測結(jié)果給出合理醫(yī)學解釋的重要依據(jù)，是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）的要求。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，以下詳細說明書的重點內(nèi)容，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預(yù)期用途】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

1.1試劑盒用于體外定性檢測經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋乳腺癌和/或胃癌組織切片中HER2基因的擴增情況。用于指導(dǎo)乳腺原發(fā)性浸潤癌和/或胃及胃食管結(jié)合部腺癌的藥物治療和/或預(yù)后評估（預(yù)后評估僅乳腺癌適用）。

1.2明確目標人群：例如對所有乳腺原發(fā)性浸潤癌原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶（如可以獲取到足夠的樣本）所有經(jīng)病理診斷證實為胃及胃食管結(jié)合部腺癌，新輔助治療后病灶及復(fù)發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶（如可以獲取到足夠的樣本）進行檢測。因腫瘤個體化診療研究和發(fā)展不斷深入，該目標人群可能隨著個體化治療藥物和試劑的研究和發(fā)展而發(fā)生變化，建議申請人參照最新指南或?qū)＜夜沧R設(shè)定申報產(chǎn)品的目標人群。

1.3簡單介紹HER2基因的生物學特征，如基本結(jié)構(gòu)、編碼蛋白及與腫瘤預(yù)后判斷、用藥指導(dǎo)的關(guān)系。

1.4簡單介紹與IHC檢測之間的關(guān)系。建議說明臨床應(yīng)用過程中首先考慮使用免疫組織化學方法檢測HER2蛋白的過表達狀態(tài)，在結(jié)果為（2+）的情況下需進一步應(yīng)用原位雜交方法確定HER2基因的擴增狀態(tài)。

1.5如未進行聯(lián)合藥物評價臨床試驗，則不應(yīng)體現(xiàn)具體藥物產(chǎn)品（商品）名稱、生產(chǎn)企業(yè)信息等，并注明該產(chǎn)品未與具體藥物聯(lián)合進行臨床評價。

1.6明確說明該試劑盒僅用于對特定腫瘤患者HER2基因擴增情況的檢測，其檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者個體化治療的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、治療反應(yīng)及其他實驗室檢測指標等因素對檢測結(jié)果進行綜合判斷。

2.【檢測原理】

簡述熒光原位雜交技術(shù)的基本原理。對特異性結(jié)合靶基因，探針長度、序列設(shè)計、標記染料名稱及標記方法，預(yù)處理、雜交與復(fù)染過程，熒光信號觀察、計數(shù)和比值計算的方法等內(nèi)容進行介紹。

3.【主要組成成分】

3.1說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息；質(zhì)控片（如有）的組織或細胞株名稱。

3.2對檢測中使用的探針信息進行簡單介紹。

3.3試劑盒中不包含但對該項檢測必需的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑、質(zhì)控片（如適用）的名稱與貨號；耗材的規(guī)格（材質(zhì)）要求；化學制劑的純度和濃度（如適用）要求及其他相關(guān)信息。

4.【儲存條件及有效期】

對試劑的儲存條件、有效期、開封穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性和凍融次數(shù)限制等信息做詳細介紹。如試劑盒包含質(zhì)控片還應(yīng)在此處明確質(zhì)控片的穩(wěn)定性。

5.【適用儀器】

明確配套適用熒光顯微鏡的配置要求，至少包括對目鏡與物鏡的放大倍率、光源及濾光片要求。對顯微鏡配套耗材（如鏡油）的要求進行介紹。

6.【樣本要求】

重點明確以下內(nèi)容：

6.1對適用樣本的取材、固定、包埋與切片的具體要求。此部分內(nèi)容可參考國際或國內(nèi)相關(guān)標準操作性文件內(nèi)容進行編寫或引用。注意不同組織類型的樣本應(yīng)分別描述。

6.2樣本的穩(wěn)定性（包括蠟塊與切片）。

7.【檢測方法】

詳細說明操作的各個步驟：

7.1明確檢測需要的儀器與設(shè)備。如烤片機、恒溫箱、水浴鍋、染色缸、雜交盒等。注明貨號及生產(chǎn)商（如需要）。

7.2試劑配制方法、注意事項，試劑開封、配制后使用方法及注意事項等。

7.3對于手工或半自動檢測，詳述脫蠟、煮片、消化、固定、核酸變性、雜交、洗滌和復(fù)染等各操作步驟。描述應(yīng)盡量細化，需明確各步驟處理時間、溫度、注意事項（如避光）等內(nèi)容。

7.4對雜交后載玻片的儲存及穩(wěn)定性、復(fù)染后的儲存及穩(wěn)定性進行說明。

7.5詳細說明質(zhì)量控制情況：

建議實驗室每次檢測設(shè)置內(nèi)對照和外對照（質(zhì)控片），以對整體操作流程進行質(zhì)量控制。評價指標應(yīng)包括細胞結(jié)構(gòu)的完整性，探針雜交信號的強度和位點的準確性，背景熒光強度，可計數(shù)信號（單色/雙色）的細胞占全部細胞的比例等。

7.5.1內(nèi)對照可為癌旁正常組織，明確樣本檢測的內(nèi)對照使用原則，如“75%以上的腫瘤細胞核中都有雜交信號時，視為檢測成功?！?/p>

7.5.2外對照可選擇已知HER2基因擴增狀態(tài)的組織切片或者細胞株，至少包括臨界值以及無擴增樣本。明確每一批次患者樣本檢測和更換使用新的試劑盒批次時，均應(yīng)同時進行質(zhì)控片檢測，以監(jiān)控檢測性能并評估信號計數(shù)的準確性。分析質(zhì)控結(jié)果不符合要求的原因并詳述處理方式。

如試劑盒內(nèi)不包含質(zhì)控片，應(yīng)明確配套使用的質(zhì)控片信息，可以為商用質(zhì)控片也可以為臨床檢測實驗室自制質(zhì)控片。自制質(zhì)控片應(yīng)為已知FISH結(jié)果的陰性和陽性質(zhì)控片，詳述質(zhì)控片的制備方法。明確質(zhì)控結(jié)果要求（試驗有效性的判斷），結(jié)果允許范圍（如適用于不同的儀器或適用于手工與儀器方法，應(yīng)分別列明結(jié)果的允許范圍）。

7.6建議強調(diào)實驗室檢測相關(guān)的儀器設(shè)備需定期維護、校驗，應(yīng)建立完善的標準操作規(guī)范文件，從事檢測的技術(shù)人員和病理醫(yī)師應(yīng)通過必要的培訓(xùn)和資格考核，做好記錄和存檔，內(nèi)部定期對不同批次檢測結(jié)果進行重復(fù)性分析；并積極參加相關(guān)的外部質(zhì)控活動。

8.【陽性判斷值】

根據(jù)相關(guān)指南及規(guī)范性文件，以HER2拷貝數(shù)平均值/細胞和/或HER2總拷貝數(shù)與CEP17總拷貝數(shù)的比值（雙信號）的形式明確陽性判斷值。

9.【檢驗結(jié)果的解釋】

9.1從細胞核形態(tài)、探針信號強度、背景情況等多方面，詳述雜交后樣本玻片的有效性評估標準。建議對不符合有效性評估標準情況發(fā)生時的常見問題及解決方法以列表的形式明確。

9.2明確目標區(qū)域的確定方法及僅對腫瘤細胞進行計數(shù)的要求；明確細胞計數(shù)的具體方法，包括每個樣本初始讀取細胞數(shù)及結(jié)果不確定樣本的處理方法。明確HER2擴增異質(zhì)性的處理方法。

可以列表的形式詳述信號計數(shù)與陰陽性判定規(guī)則，應(yīng)配合清晰彩圖圖例。例如對于浸潤性乳腺癌，描述為“找到至少2個浸潤癌區(qū)域，隨機計數(shù)至少20個浸潤癌細胞核中的雙色信號，計算信號比值（比值=計數(shù)細胞核中紅色信號總數(shù)/計數(shù)細胞核中綠色信號總數(shù)），根據(jù)以下標準對樣本進行HER2基因擴增陰陽性的判斷：比值≥2.0，或者比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/CEP17拷貝數(shù)≥6.0時為陽性；擴增細胞應(yīng)均質(zhì)、連續(xù)，且占浸潤癌的10％以上。比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細胞<4.0時為陰性。HER2/CEPl7比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細胞<6.0，但≥4.0時為不確定。對于不確定的樣本，需再計算20個細胞核中的信號，或由另一閱片人重新計數(shù)?！?/p>

10.【檢驗方法的局限性】

綜合產(chǎn)品的預(yù)期用途、臨床背景、檢測方法及適用范圍等信息，對可能出現(xiàn)的局限性進行相關(guān)說明，主要包括以下描述，請申請人選擇適用的條款在產(chǎn)品說明書中予以闡述。

10.1本試劑盒為體外診斷試劑，檢測結(jié)果的臨床判定均應(yīng)結(jié)合患者醫(yī)療病史和其他臨床診斷結(jié)果進行綜合評估，不得作為臨床診治的唯一依據(jù)。

10.2腫瘤組織HER2基因表達的異質(zhì)性可能影響檢測結(jié)果。例如可導(dǎo)致IHC與ISH檢測、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶、活檢標本與手術(shù)切除標本的檢測結(jié)果不一致。異質(zhì)性在胃癌中更常見。對于胃鏡活檢標本，多點活檢有助于減少腫瘤異質(zhì)性的影響，提高檢測的準確性。另外，新輔助治療會影響胃癌HER2狀態(tài)，治療前活檢標本和治療后手術(shù)標本的綜合判斷有助于更好的用藥指導(dǎo)。

10.3本試劑盒檢測結(jié)果受樣本來源、樣本采集過程、樣本質(zhì)量、樣本運輸條件、樣本預(yù)處理等因素影響。同時由于結(jié)果判斷的主觀性，可能導(dǎo)致得出假陽性或假陰性的檢測結(jié)果，使用者應(yīng)了解檢測過程中可能存在的潛在錯誤導(dǎo)致結(jié)果不準確等局限性。

10.4檢測結(jié)果如與組織病理學特征不符，應(yīng)核實病理診斷或重新檢測。

10.5本產(chǎn)品的性能指標是基于說明書所述檢測程序獲得，對該程序進行更改，可能會改變該檢驗的結(jié)果。

10.6本試劑僅對經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋的組織進行了驗證（如適用），不得用于其他樣本類型或流式細胞檢測等其他用途。

11.【產(chǎn)品性能指標】

根據(jù)分析性能評估研究結(jié)果，詳述以下性能指標，包括研究方法和評估結(jié)果：

11.1靈敏度：在乳腺浸潤癌/胃癌病例的組織樣本，以及癌旁正常組織或者良性疾病組織樣本中探針與目標基因位點的結(jié)合效率。

11.2特異性：HER2和CEP17探針對目標序列識別的特異性。

11.3陰、陽性符合率：在不同組織類型中HER2基因的檢出能力和準確性。

11.4精密度：批內(nèi)、批間精密度及不同時間、地點、檢測系統(tǒng)（如適用）、人員之間的精密度。

11.5臨床試驗數(shù)據(jù)總結(jié)。

12.【注意事項】

12.1有關(guān)試劑盒內(nèi)人源組分（如有）生物安全性的警告。

12.2有關(guān)實驗操作中涉及試劑的安全性提示，包括對有毒有害物質(zhì)的防護及危險物品的處理方法等。

12.3熒光染料在光照條件下容易淬滅。為降低該影響，對所有含熒光探針的溶液，包括雜交后樣本載玻片均應(yīng)盡量避免或者減少在光照條件下保存和處理。

12.4使用校準過的溫度計測定溶液、水浴槽和溫箱溫度。

三、編寫單位

國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心。