附件：人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型、試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2015年第93號(hào)）.doc

人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型、試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對(duì)人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑注冊申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門審評(píng)注冊申報(bào)資料提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對(duì)人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供申請人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件，不涉及注冊審批等行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如有能夠滿足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、范圍

人乳頭瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）屬于乳頭瘤病毒科，是一種小分子的、無被膜包被的1、環(huán)狀雙鏈DNA病毒，基因組長約8000堿基對(duì)（bp），分為3個(gè)功能區(qū)，即早期轉(zhuǎn)錄區(qū)（E區(qū)）、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)（L區(qū)）和非轉(zhuǎn)錄區(qū)（長控制區(qū)，LCR）。HPV通過直接或間接接觸污染物品或性傳播感染人類。該病毒不但具有宿主特異性，而且具有組織特異性，只能感染人的皮膚和粘膜上皮細(xì)胞，引起人類皮膚的多種乳頭狀瘤或疣及生殖道上皮增生性損傷。

對(duì)于感染生殖道和肛門的HPV，根據(jù)各基因型別致病力大小或致癌危險(xiǎn)性大小可分為低危型和高危型兩大類。在有性生活史的女性中生殖道HPV感染具有普遍性，據(jù)統(tǒng)計(jì)70%～80%的女性在其一生中會(huì)有至少一次的HPV感染，但大多數(shù)感染為自限性，超過90％的感染的女性會(huì)出現(xiàn)一種有效的免疫應(yīng)答，在沒有任何長期的健康干預(yù)時(shí)在6到24個(gè)月之間可以清除感染。而持續(xù)性的高危型HPV感染則是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的主要原因。全球范圍的研究結(jié)果顯示，在99.7%的宮頸癌患者體內(nèi)檢測到高危型HPV DNA的存在，其中HPV16型、18型、45型和31型感染占80%。低危型HPV一般與尖銳濕疣或低度鱗狀上皮內(nèi)病變相關(guān)，極少引起浸潤癌。關(guān)于高危型與低危型的劃分，國際上許多機(jī)構(gòu)都給出了參考建議，依據(jù)WHO國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）及其他國際組織的研究成果，本指導(dǎo)原則建議將HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種基因型列為高危型別，26、53、66、73、82等5種基因型列為中等風(fēng)險(xiǎn)型別，本指導(dǎo)原則中所述的檢測試劑及其要求均只針對(duì)用于宮頸癌相關(guān)預(yù)期用途的（上述18種）HPV基因型核酸檢測，如申報(bào)的宮頸癌相關(guān)HPV核酸檢測產(chǎn)品涉及上述18種型別以外的其他HPV基因型，則申請人需提出明確的理由和依據(jù)，且應(yīng)得到國際有關(guān)權(quán)威機(jī)構(gòu)的文獻(xiàn)支持。下文中述及“高危型”均泛指此18種HPV基因型。

多年來，國際上通用的宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的診斷主要遵循“三階梯式”診斷程序，即宮頸細(xì)胞學(xué)、陰道鏡及組織病理學(xué)檢查。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查是普遍應(yīng)用的宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的篩查方法，可發(fā)現(xiàn)早期病變。但宮頸細(xì)胞學(xué)檢查存在其固有的局限性。高危型HPV檢測用于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查異常患者的分流及宮頸癌篩查，可有效地增加宮頸病變檢出率，提高細(xì)胞學(xué)檢查敏感性，并降低篩查頻率。

本文所述人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑是指利用包括PCR-熒光探針法或其他分子生物學(xué)方法在內(nèi)的核酸檢測技術(shù)，以特定高危型HPV核酸（包括DNA和RNA）序列為檢測目的，對(duì)人宮頸樣本(如人宮頸脫落上皮細(xì)胞或分泌物等)進(jìn)行體外定性檢測的試劑，以確定受試樣本中是否存在高于陽性判斷值水平的高危型HPV病毒，或同時(shí)鑒定感染HPV的基因型別。此類試劑在臨床上用于：1）篩查宮頸細(xì)胞學(xué)檢查為ASC-US（意義未確定的非典型鱗狀上皮細(xì)胞）結(jié)果的患者，以確定是否需要進(jìn)行陰道鏡檢查（以下簡稱ASC-US人群分流用途）；2）對(duì)于30歲及以上的女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，與宮頸細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合進(jìn)行宮頸癌篩查，此檢測結(jié)合細(xì)胞學(xué)病史和其他風(fēng)險(xiǎn)因素的評(píng)估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導(dǎo)患者的管理(以下簡稱宮頸癌聯(lián)合篩查用途)；3）對(duì)于某年齡段（根據(jù)臨床試驗(yàn)結(jié)果而定）女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，進(jìn)行宮頸癌篩查，此檢測結(jié)合細(xì)胞學(xué)病史和其他風(fēng)險(xiǎn)因素的評(píng)估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導(dǎo)患者的管理（以下簡稱宮頸癌初篩用途）。除此以外，若申請人提出其他的預(yù)期用途，則應(yīng)詳細(xì)描述相關(guān)的臨床背景信息和該檢測與臨床用途的相關(guān)性，并在臨床試驗(yàn)中充分驗(yàn)證相關(guān)的臨床意義。本指導(dǎo)原則僅針對(duì)上述三種預(yù)期用途提出相關(guān)要求。

這里所述的HPV核酸檢測試劑是指可同時(shí)檢測多種基因型HPV但不能對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行基因分型的試劑，HPV基因分型試劑是指檢測多種基因型HPV的同時(shí)可以對(duì)HPV陽性結(jié)果進(jìn)行基因分型的試劑。

關(guān)于本指導(dǎo)原則所述產(chǎn)品的預(yù)期用途還有以下幾點(diǎn)需要強(qiáng)調(diào)。第一，在年齡＜30歲的女性中，雖然HPV感染率很高，但其自主清除率也很高，因此對(duì)于細(xì)胞學(xué)檢查正常的受試者不建議再采用HPV檢測做聯(lián)合篩查，在經(jīng)過臨床試驗(yàn)證實(shí)的基礎(chǔ)上亦可直接采用HPV檢測作為初篩方法；此類HPV核酸檢測試劑對(duì)不同年齡段人群的適用情況應(yīng)符合相關(guān)宮頸癌篩查指南的要求。第二，HPV核酸檢測試劑用于ASC-US人群分流或?qū)m頸癌篩查時(shí)，其可覆蓋的HPV基因型別應(yīng)至少包含16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型（共13種），亦可同時(shí)包含26、53、66、73、82型中的一個(gè)或數(shù)個(gè)型別；根據(jù)現(xiàn)有的研究成果，若可檢測的HPV基因型別不能涵蓋上述13種高危型，則可能造成陰性預(yù)期值無法達(dá)到臨床要求，因此不建議單獨(dú)用于上述預(yù)期用途。對(duì)于基因分型試劑，目前的研究數(shù)據(jù)已證實(shí)16、18型的基因分型檢測用于輔助（宮頸癌篩查中）HPV核酸檢測陽性結(jié)果的分析，是有臨床意義的，可以進(jìn)行注冊申請，申請人應(yīng)合理陳述預(yù)期用途，其性能評(píng)估和臨床試驗(yàn)中適用于本指導(dǎo)原則的部分應(yīng)參照執(zhí)行；但應(yīng)注意：并非所有HPV基因型的分型檢測均有確定的臨床意義，申請人在研發(fā)HPV基因分型檢測試劑時(shí)應(yīng)以臨床研究結(jié)果為基礎(chǔ)，而不應(yīng)盲目擴(kuò)大分型范圍。第三，低危型HPV一般與尖銳濕疣或低度鱗狀上皮內(nèi)病變相關(guān)，但其檢測的臨床價(jià)值尚不明確，若申請人提出相關(guān)產(chǎn)品注冊，則應(yīng)詳細(xì)解釋其臨床意義和適應(yīng)癥，并提供充分的證據(jù)。第四，鑒于此類試劑的樣本采集方法不利于量值溯源，無法保證定量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此建議檢測試劑定位為定性檢測，本指導(dǎo)原則不適用于進(jìn)行定量或半定量HPV核酸檢測試劑的注冊；最后，本指導(dǎo)原則只針對(duì)與宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌相關(guān)的高危型HPV檢測，不適用于除宮頸樣本外其他樣本類型的檢測。

本指導(dǎo)原則適用的檢測方法主要指基于核酸檢測的分子生物學(xué)技術(shù)?，F(xiàn)有HPV核酸檢測技術(shù)主要包括雜交捕獲法、酶切信號(hào)放大法、PCR-熒光探針法、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)以及PCR-雜交法等。這些方法在性能評(píng)價(jià)上可能會(huì)略有差異，但在技術(shù)指標(biāo)方面均適用于本指導(dǎo)原則，以下有關(guān)注冊申報(bào)資料的要求主要針對(duì)PCR-熒光探針法提出，其他方法學(xué)試劑應(yīng)針對(duì)產(chǎn)品自身特點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)補(bǔ)充或修正。

由于宮頸癌篩查涉及面廣，故由假陰性和假陽性HPV檢測結(jié)果引起的潛在公共衛(wèi)生損害風(fēng)險(xiǎn)較為顯著。假陰性結(jié)果可能導(dǎo)致宮頸癌診斷和治療不及時(shí)，假陽性結(jié)果可能導(dǎo)致不必要的頻繁篩查和侵襲性處置。因此，確立良好的性能指標(biāo)并充分理解HPV檢測的臨床意義，對(duì)于此類產(chǎn)品的安全有效性評(píng)價(jià)至關(guān)重要。產(chǎn)品性能如不符合臨床需求，可能導(dǎo)致對(duì)患者所作的決策錯(cuò)誤?？傮w來說，此類試劑分析及臨床性能的評(píng)價(jià)應(yīng)有嚴(yán)格的控制，同時(shí)亦應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注臨床的合理應(yīng)用和檢測結(jié)果的科學(xué)解釋。

本指導(dǎo)原則僅包括對(duì)人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑注冊申報(bào)資料中部分項(xiàng)目的要求，適用于進(jìn)行產(chǎn)品注冊和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。其他未盡事宜（包括產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)分析資料等），應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（總局令第5號(hào)）（以下簡稱《辦法》）等相關(guān)法規(guī)和文件的要求。

二、注冊申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

此類產(chǎn)品的綜述資料中，與預(yù)期用途相關(guān)的臨床適應(yīng)征背景情況的描述應(yīng)著重于高危型HPV核酸檢測和宮頸癌之間的相關(guān)性，及HPV檢測臨床應(yīng)用的限定要求，陳述應(yīng)科學(xué)、客觀且有依據(jù)。與國內(nèi)外同類產(chǎn)品的比較內(nèi)容應(yīng)著重從方法學(xué)及HPV基因型檢出能力等方面進(jìn)行比較。綜述資料的撰寫應(yīng)符合《辦法》和《體外診斷試劑注冊申報(bào)資料要求及說明》（總局公告2014年第44號(hào)）（以下簡稱44號(hào)公告）的相關(guān)要求。

（二）主要原材料研究資料

此類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）及企業(yè)參考品、試劑盒對(duì)照品（質(zhì)控品）等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料、對(duì)照品（質(zhì)控品）的定值試驗(yàn)資料等。

1.引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，針對(duì)所有預(yù)期適用的HPV基因型別進(jìn)行檢出能力和特異性（如交叉反應(yīng)）的評(píng)價(jià)，選擇最佳組合，并提交篩選的研究數(shù)據(jù)。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括純度檢查、濃度檢查及功能性實(shí)驗(yàn)等。

2.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括DNA聚合酶活性、核酸內(nèi)切酶活性、熱啟動(dòng)能力、熱穩(wěn)定性等；還可能涉及尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）和逆轉(zhuǎn)錄酶，亦應(yīng)分別對(duì)其酶活性等進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。

3.dNTP：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括純度檢查及功能性實(shí)驗(yàn)等。

4.若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定，并提交生產(chǎn)工藝驗(yàn)證報(bào)告；如主要原材料購自其他供應(yīng)商，則需針對(duì)供應(yīng)商的選擇提供評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，并提供供應(yīng)商出具的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告，以及申請人對(duì)該原材料進(jìn)行的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。

5.企業(yè)參考品：應(yīng)詳細(xì)說明有關(guān)企業(yè)參考品的原料選擇、制備、定值過程等試驗(yàn)資料。

企業(yè)參考品的核酸性質(zhì)（DNA或RNA）應(yīng)與產(chǎn)品預(yù)期檢測的靶物質(zhì)一致。鑒于HPV病毒尚不能體外培養(yǎng)，企業(yè)參考品可采用感染HPV的細(xì)胞系，也可采用人工克隆或合成的HPV基因組DNA（或轉(zhuǎn)錄RNA）等。具體要求如下：

5.1陽性參考品和陰性參考品

無論試劑盒能否進(jìn)行HPV基因分型，陽性參考品均應(yīng)針對(duì)所有適用的HPV基因型分別設(shè)置。陰性參考品應(yīng)考慮檢測特異性的評(píng)價(jià)，適當(dāng)納入其他HPV基因型樣品和其他病原體樣品。

5.2 檢測限參考品

可選擇檢測限濃度或略高于檢測限濃度，并針對(duì)不同基因型分別設(shè)置。

5.3 精密度參考品

可不包含所有涉及的HPV基因型，但應(yīng)選擇臨床較常見的或風(fēng)險(xiǎn)程度較高的基因型（至少包含16或18型），并至少設(shè)置一個(gè)弱陽性水平。

6.試劑盒對(duì)照品（質(zhì)控品）

試劑盒的質(zhì)控體系通過設(shè)置各種試劑盒對(duì)照品（質(zhì)控品）來實(shí)現(xiàn)。陽性對(duì)照品（質(zhì)控品）的核酸性質(zhì)應(yīng)與待測樣本的靶核酸性質(zhì)一致，如同為DNA或RNA，其中可不包含所有涉及的HPV基因型，但應(yīng)選擇臨床較常見的或風(fēng)險(xiǎn)程度較高的基因型，并至少包含16或18型。陰性對(duì)照品（質(zhì)控品）應(yīng)參與樣本處理和檢測的全過程，如核酸的平行提取等步驟。企業(yè)應(yīng)對(duì)陽性對(duì)照品（質(zhì)控品）的檢測結(jié)果（如Ct值）做出明確的范圍要求。

內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）可以對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，申請人應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針設(shè)計(jì)和模板濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對(duì)靶基因檢測造成的抑制。對(duì)內(nèi)對(duì)照的檢測結(jié)果（如Ct值）亦應(yīng)做出明確的范圍要求。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1.介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可以圖表方式表示，并說明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.反應(yīng)原理介紹。

3.詳述樣本收集液、樣本處理方式的選擇和設(shè)置，提供相關(guān)的研究資料。

4.確定最佳反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。

5.不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。

6.如申報(bào)產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸分離/純化過程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。

（四）分析性能評(píng)估資料

申請人應(yīng)提交生產(chǎn)者在產(chǎn)品研制階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能評(píng)價(jià)的研究資料，對(duì)于每項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)都應(yīng)包括具體研究目的、試驗(yàn)方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)、臨床樣本來源等。

針對(duì)不同的樣本采集方式，可能有不同的樣本收集液，申請人應(yīng)對(duì)不同的樣本收集液情況分別完成性能評(píng)估，包括最低檢測限和精密度評(píng)價(jià)等，證明不同的樣本采集方式不會(huì)影響試劑的分析性能。

分析性能評(píng)價(jià)的試驗(yàn)方法可以參考相關(guān)的美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)批準(zhǔn)指南（CLSI-EP）文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷試劑性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。對(duì)于此類產(chǎn)品，性能評(píng)估中所用樣品（除非特別說明）可參考上述企業(yè)參考品的制備要求。各項(xiàng)性能評(píng)價(jià)應(yīng)符合以下要求。

1.核酸分離/純化性能（如適用）

在進(jìn)行靶核酸檢測前，應(yīng)有適當(dāng)?shù)暮怂岱蛛x/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)結(jié)合檢測試劑的特性，對(duì)配合使用的核酸分離/純化試劑的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗(yàn)證，提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

2.陽性/陰性參考品符合率

陽性參考品的檢測旨在驗(yàn)證各種HPV基因型均可以在適當(dāng)?shù)臐舛缺粰z測到。陰性參考品則應(yīng)檢測為陰性。

3.最低檢測限

針對(duì)每種不同的HPV基因型分別配制系列稀釋的樣品進(jìn)行最低檢測限的評(píng)價(jià)，系列稀釋度應(yīng)能夠覆蓋大部分檢出概率區(qū)間（0～100%），可通過概率計(jì)算或其他適當(dāng)方法進(jìn)行測算選取適當(dāng)檢出率水平的濃度作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)，如95%（n≥20）或100%的陽性檢出率水平。

4.分析特異性

4.1交叉反應(yīng)

申請人應(yīng)針對(duì)可在人類泌尿、生殖道寄生微生物或經(jīng)性傳播的病原體等進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證，用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的樣品，除HPV外，其他病原體應(yīng)盡量采用滅活病原體培養(yǎng)物或臨床樣本。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證，通常，細(xì)菌感染的水平為106 CFU/mL或更高，病毒為105 PFU/mL或更高。申請人應(yīng)詳細(xì)說明交叉反應(yīng)樣本來源、病原體鑒定和滴度確定的方法和結(jié)果。病原體種類主要考慮以下幾方面：預(yù)期用途不包含的其他基因型HPV、人類泌尿、生殖道寄生微生物或可經(jīng)性傳播的其他病原體、其他常見病原體。（詳見表1）

此外，申請人應(yīng)針對(duì)被檢測靶序列與人基因組及可能存在于人類泌尿、生殖道的微生物基因組進(jìn)行基因序列比對(duì)，并提交比對(duì)結(jié)果，如有同源性序列則應(yīng)進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證。

表1　用于交叉反應(yīng)研究的病原體

（其中標(biāo)記*的項(xiàng)目為必做項(xiàng)目）

4.2干擾試驗(yàn)

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對(duì)可能存在的干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)，并針對(duì)有代表性的HPV基因型（如16、18型），至少在HPV臨界陽性水平進(jìn)行干擾試驗(yàn)驗(yàn)證。干擾物質(zhì)的選取應(yīng)至少包括：血紅蛋白、白細(xì)胞、宮頸粘液、陰道避孕藥物、女性衛(wèi)生用品、陰道用抗真菌藥物、陰道潤滑劑等。

5.精密度

企業(yè)應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。鑒于HPV病毒尚不能體外培養(yǎng)，因此可以采用感染HPV的細(xì)胞系，也可采用人工克隆或合成的HPV基因組DNA（或轉(zhuǎn)錄RNA）等代替；但模擬樣本并不能體現(xiàn)臨床樣本可能帶來的所有變異因素，因此精密度評(píng)價(jià)中應(yīng)同時(shí)包含若干臨床樣本，且精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸分離/純化步驟。針對(duì)本類產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求。

（1）對(duì)可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對(duì)分析儀、操作者、地點(diǎn)、檢測輪次等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。

（2）設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少20天的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

（3）用于精密度評(píng)價(jià)的人工模擬樣品和臨床樣本均應(yīng)至少包含3個(gè)水平：陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強(qiáng)）陽性樣品，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，其中，人工模擬樣品應(yīng)針對(duì)所有適用的HPV基因型別分別設(shè)置，臨床樣本精密度評(píng)價(jià)中的每一次檢測均應(yīng)從核酸提取開始。

（五）陽性判斷值確定資料

對(duì)于此類試劑，陽性判斷值即為能夠獲得理想的臨床靈敏度和臨床特異性的臨界值（Cutoff），對(duì)于熒光探針PCR方法即為Ct值的確定資料，對(duì)于PCR-點(diǎn)雜交法即為最低檢測限（LoD）。建議采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進(jìn)行相關(guān)研究。申請人可選取適當(dāng)?shù)呐R床樣本進(jìn)行初步試驗(yàn)以確定陽性判斷值，并在后續(xù)臨床試驗(yàn)中確認(rèn)其適用性，亦可將此研究納入下文所述的有關(guān)ASC-US人群分流的臨床試驗(yàn)中；無論采用何種方式均應(yīng)明確樣本入組標(biāo)準(zhǔn)，并說明試驗(yàn)方案及其合理性。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，以及試劑開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究。后者則是指適用樣本的保存條件、保存時(shí)間等方面的研究，如樣本采集方法不同，則需分別完成穩(wěn)定性研究。對(duì)于此類試劑，如核酸提取液不一定立即進(jìn)行檢測，則還需對(duì)核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

在穩(wěn)定性研究中，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臏囟确秶?，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，申請人應(yīng)提交有關(guān)穩(wěn)定性研究方案的確定依據(jù)、具體的試驗(yàn)方法及詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)、結(jié)論。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】兩項(xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說明。

（七）臨床試驗(yàn)

臨床試驗(yàn)的開展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）的要求。

1.試驗(yàn)方法

此類產(chǎn)品的臨床試驗(yàn)應(yīng)包括兩部分內(nèi)容，第一部分為HPV核酸檢測準(zhǔn)確性驗(yàn)證；第二部分則為試劑盒針對(duì)具體預(yù)期用途的臨床有效性驗(yàn)證。兩部分臨床試驗(yàn)的具體方法應(yīng)滿足如下要求：

1.1 HPV核酸檢測準(zhǔn)確性驗(yàn)證

申請人應(yīng)選擇已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品和/或核酸序列測定方法作為對(duì)比方法，采用擬申報(bào)產(chǎn)品與之進(jìn)行比較研究試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)擬申報(bào)產(chǎn)品檢測目標(biāo)HPV基因型的能力。需要注意的是，當(dāng)擬申報(bào)產(chǎn)品的陽性判斷值高于最低檢測限水平時(shí)，檢測結(jié)果判定為“陰性”的情況包括兩種，其一為待測樣本中存在高于最低檢測限水平的HPV靶核酸，但靶核酸水平低于陽性判斷值；其二為待測樣本中無HPV靶核酸，或靶核酸水平低于最低檢測限水平。在檢測結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析中應(yīng)分別列明各種情況，可參考表2。

表2 HPV核酸檢測結(jié)果

病例選擇及樣本類型：受試者應(yīng)包含各種臨床表現(xiàn)的人群，如：宮頸細(xì)胞學(xué)檢查正常者、宮頸上皮細(xì)胞異常者以及診斷為宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）和宮頸浸潤癌等的患者，受試者年齡應(yīng)在<30、30～39、40歲以上年齡段均有分布。樣本類型為人宮頸樣本，總例數(shù)不少于500例。對(duì)于基因分型試劑的臨床試驗(yàn)，每種HPV基因型均應(yīng)具有一定的陽性例數(shù)。

鑒于此類產(chǎn)品的樣本采集方法不易標(biāo)準(zhǔn)化，而樣本采集過程對(duì)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，因此，如產(chǎn)品可采用不止一種樣本采集方法（包括使用的采集設(shè)備和樣本收集液），則應(yīng)針對(duì)不同的采集方式進(jìn)行同源樣本的比較研究試驗(yàn)，證明不同的樣本采集方式不會(huì)影響檢測結(jié)果。相關(guān)比較研究試驗(yàn)應(yīng)于2家以上（含兩家）臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行，樣本例數(shù)不少于100例。

對(duì)比試劑：應(yīng)選取已上市同類產(chǎn)品和/或核酸序列測定方法。鑒于不同的產(chǎn)品其預(yù)期用途涵蓋的基因型別不盡相同，因此應(yīng)充分考慮對(duì)比方法的適用范圍和檢測性能等，確保其與擬申報(bào)產(chǎn)品具有可比性。必要時(shí)，可同時(shí)選取超過一種對(duì)比方法，但應(yīng)以一種方法為主。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)比較研究試驗(yàn)的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行合理分析。對(duì)于此類試劑的比較研究試驗(yàn)，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種方法定性檢測結(jié)果，計(jì)算陽性符合率、陰性符合率和總符合率，并計(jì)算95%置信區(qū)間，對(duì)定性檢測結(jié)果進(jìn)行配對(duì)四格表χ2檢驗(yàn)或kappa檢驗(yàn)，以考察兩種方法檢測結(jié)果的一致性。

對(duì)于基因分型試劑，臨床試驗(yàn)中應(yīng)分別驗(yàn)證該產(chǎn)品對(duì)可鑒別HPV基因型的臨床檢測準(zhǔn)確性，針對(duì)不同基因型HPV分別完成如上所述的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié)果差異樣本的分析和驗(yàn)證：對(duì)于兩種方法的檢測結(jié)果不一致的樣本，申請人應(yīng)針對(duì)具體情況進(jìn)行合理分析，必要時(shí)選擇其他合理的方法進(jìn)行驗(yàn)證，亦可結(jié)合患者的臨床病情進(jìn)行分析。

有關(guān)核酸序列測定方法的資料要求：臨床試驗(yàn)中如涉及核酸序列測定方法，則建議對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行雙向測序。應(yīng)在臨床研究報(bào)告中對(duì)選用的測序方法做詳細(xì)介紹，并提供以下關(guān)于測序試驗(yàn)的詳細(xì)信息及資料。

1)測序方法原理、測序儀型號(hào)、測序試劑及消耗品的相關(guān)信息。

2)測序方法所用引物相關(guān)信息，如基因區(qū)段選擇，分子量、純度、功能性試驗(yàn)等資料。

3)對(duì)所選測序方法的分析性能進(jìn)行合理驗(yàn)證，尤其是最低檢測限的確認(rèn)，建議將所選測序方法與擬申報(bào)產(chǎn)品的相關(guān)性能進(jìn)行適當(dāng)比對(duì)分析。

4)測序方法應(yīng)建立合理的陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對(duì)臨床樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。

5)提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。

1.2針對(duì)預(yù)期用途的臨床有效性驗(yàn)證

1.2.1針對(duì)ASC-US人群分流用途，申請人應(yīng)在適合進(jìn)行宮頸細(xì)胞學(xué)檢查的女性中，入組宮頸細(xì)胞學(xué)檢查為ASC-US的受試者，應(yīng)避免選取已確定需進(jìn)行陰道鏡檢查的人群，以免造成入組人群的傾向性。入組人群應(yīng)盡量在不同的年齡范圍均有分布（<30、30～39和40以上），各年齡組受試者例數(shù)至少應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。針對(duì)入組的ASC-US人群首先采用擬申報(bào)產(chǎn)品進(jìn)行HPV核酸檢測，然后，無論HPV檢測結(jié)果如何，均應(yīng)進(jìn)行陰道鏡檢查，根據(jù)陰道鏡檢查結(jié)果，必要時(shí)取樣進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。建議采用同一份宮頸上皮細(xì)胞樣本進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查和HPV檢測，以避免樣本取材不同帶來的偏差；而宮頸細(xì)胞樣本采集與陰道鏡檢查之間的時(shí)間間隔不應(yīng)過長，建議不超過12周。以陰道鏡檢查和組織病理學(xué)檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)擬申報(bào)產(chǎn)品的臨床靈敏度、臨床特異性、陽性預(yù)期值、陰性預(yù)期值、陽性似然比、陰性似然比，并采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ?jì)算95%置信區(qū)間；對(duì)于基因分型試劑，還需針對(duì)可鑒別的基因型單獨(dú)完成上述數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)能夠支持基因分型的臨床意義；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析方法參見表3和表4。

臨床試驗(yàn)結(jié)果：應(yīng)通過分析陽性似然比和陰性似然比的結(jié)果判斷擬申報(bào)產(chǎn)品用于ASC-US人群分流的臨床性能是否能夠滿足臨床要求。

樣本例數(shù)：應(yīng)根據(jù)檢測試劑靈敏度要求、疾病發(fā)病率等對(duì)入組樣本例數(shù)進(jìn)行科學(xué)的分析和計(jì)算，臨床試驗(yàn)終點(diǎn)病理學(xué)檢查結(jié)果≥CIN2的例數(shù)應(yīng)不少于60例。

表3 在ASC-US人群中HPV核酸檢測結(jié)果與疾病狀態(tài)相關(guān)性

針對(duì)≥CIN2水平的臨床性能評(píng)價(jià)：

臨床靈敏度= (A4+A5)/(A4+B4+A5+B5)

臨床特異性= (B1+B2+B3)/(A1+B1+A2+B2+A3+B3)

陽性預(yù)期值（PPV）=(A4+A5)/(A1+A2+A3+A4+A5)

陰性預(yù)期值（NPV）=(B1+B2+B3)/(B1+B2+B3+B4+B5)

陽性似然比=臨床靈敏度/（1-臨床特異性）

陰性似然比=（1-臨床靈敏度）/臨床特異性

針對(duì)≥CIN3水平的臨床性能評(píng)價(jià)：

臨床靈敏度= A5/(A5+B5);

臨床特異性= (B1+B2+B3+B4)/(A1+B1+A2+B2+A3+B3+A4+B4)

陽性預(yù)期值（PPV）=A5/(A1+A2+A3+A4+A5)

陰性預(yù)期值（NPV）=(B1+B2+B3+B4)/(B1+B2+B3+B4+B5)

陽性似然比=臨床靈敏度/（1-臨床特異性）

陰性似然比=（1-臨床靈敏度）/臨床特異性

表4在ASC-US人群中HPV基因分型檢測結(jié)果

與疾病狀態(tài)相關(guān)性

1.2.2針對(duì)宮頸癌聯(lián)合篩查用途，入組的受試人群應(yīng)為無宮頸上皮內(nèi)病變（NILM）的30歲以上女性。

基礎(chǔ)檢測：入組人群應(yīng)分別接受擬申報(bào)產(chǎn)品的HPV檢測，記為基礎(chǔ)檢測數(shù)據(jù)，其中，若擬申報(bào)產(chǎn)品可進(jìn)行16、18型HPV分型檢測，則16、18型陽性的受試者應(yīng)立即進(jìn)行陰道鏡檢查，必要時(shí)結(jié)合組織病理學(xué)檢查，結(jié)果為≥CIN2的受試者判為“陽性”，不再進(jìn)行下述隨訪，其他受試者進(jìn)入隨訪程序。

受試者隨訪：隨訪時(shí)間建議至少持續(xù)三年。基礎(chǔ)檢測結(jié)果HPV陽性的受試者每年接受隨訪，HPV陰性的受試者每三年接受一次隨訪，以及在隨訪終點(diǎn)接受隨訪。隨訪中應(yīng)對(duì)受試者進(jìn)行宮頸細(xì)胞學(xué)檢查，其中檢查結(jié)果為正常者繼續(xù)隨訪，結(jié)果為≥ASC-US的受試者則應(yīng)進(jìn)行陰道鏡檢查，必要時(shí)結(jié)合組織病理學(xué)檢查，結(jié)果為≥CIN2的受試者判為“陽性”，并終止隨訪，其他均應(yīng)持續(xù)至隨訪終點(diǎn)，最終未發(fā)展為≥CIN2的受試者判為“陰性”。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：針對(duì)HPV基礎(chǔ)檢測結(jié)果為陰性和陽性的受試者分別評(píng)價(jià)其發(fā)展為≥CIN2的絕對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值和發(fā)展為≥CIN3的絕對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值，計(jì)算HPV陽性組相對(duì)于陰性組發(fā)展為≥CIN2和≥CIN3的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值及95%置信區(qū)間，應(yīng)與“1”具有顯著性差異。對(duì)于HPV基因分型檢測試劑，還應(yīng)分別評(píng)估可鑒別基因型陽性結(jié)果如HPV16+、HPV18+、HPV16和/或18+等相對(duì)于HPV陰性和相對(duì)于其他HPV基因型別陽性的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，以及其他HPV基因型別陽性及HPV陽性相對(duì)于HPV陰性的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。計(jì)算相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值的95%置信區(qū)間，應(yīng)與“1”具有顯著性差異。此外，HPV陰性人群的絕對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值應(yīng)足夠低，以證明該方法對(duì)陰性人群的保護(hù)作用。最后，應(yīng)給出受試人群總體的≥CIN2絕對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值和≥CIN3絕對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值。風(fēng)險(xiǎn)值的計(jì)算可參考如下方法（表5和表6）：

表5 HPV檢測結(jié)果和疾?。ā軨IN2）狀態(tài)相關(guān)性

表6 ≥CIN2的風(fēng)險(xiǎn)值計(jì)算

95%置信區(qū)間的計(jì)算方法推薦：Altman等人提出的Score Method或Clopper等人提出的Clopper-Pearson Method。

樣本要求：此項(xiàng)臨床試驗(yàn)的入組人群應(yīng)盡量在不同的年齡范圍均有分布（30～39和40以上）。應(yīng)根據(jù)檢測試劑靈敏度要求、疾病發(fā)病率等對(duì)入組樣本例數(shù)進(jìn)行科學(xué)的分析和計(jì)算，并根據(jù)臨床實(shí)際情況對(duì)病例脫落比例設(shè)定合理要求，隨訪終點(diǎn)病理學(xué)檢查結(jié)果≥CIN2的例數(shù)應(yīng)不少于60例。

1.2.3針對(duì)宮頸癌初篩用途，申請人應(yīng)按照此項(xiàng)預(yù)期用途所述，隨機(jī)選取需接受常規(guī)宮頸癌篩查且宮頸細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果未知的女性作為受試者。

基礎(chǔ)檢查：所有受試者分別進(jìn)行HPV檢測和細(xì)胞學(xué)檢查，作為基礎(chǔ)檢查數(shù)據(jù)；其中，（HPV基因分型試劑）檢測結(jié)果為16/18型（或其他可鑒別基因型）陽性的受試者、HPV陽性同時(shí)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果≥ASC-US的受試者應(yīng)立即進(jìn)行陰道鏡檢查，必要時(shí)結(jié)合組織病理學(xué)檢查，結(jié)果為≥CIN2的受試者判為“陽性”，不再進(jìn)行下述隨訪，其他受試者進(jìn)入隨訪程序。

受試者隨訪：隨訪時(shí)間至少持續(xù)三年?；A(chǔ)檢查結(jié)果HPV陽性或細(xì)胞學(xué)檢查≥ASC-US的受試者每年接受隨訪，HPV陰性且細(xì)胞學(xué)檢查為正常的受試者每三年接受一次隨訪，以及在隨訪終點(diǎn)接受隨訪。隨訪方法與上述第1.2.2條所述一致，至至少三年或組織病理學(xué)檢查結(jié)果為≥CIN2。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：可參照上述第1.2.2條所述方法，HPV+組相對(duì)于HPV-組應(yīng)呈現(xiàn)具有顯著性差異的高風(fēng)險(xiǎn)值,NILM組相對(duì)于HPV-組應(yīng)呈現(xiàn)具有顯著差性異的高風(fēng)險(xiǎn)值。對(duì)于HPV基因分型檢測試劑，還應(yīng)分別評(píng)估可鑒別基因型陽性結(jié)果如HPV16+、HPV18+、HPV16和/或18+等相對(duì)于HPV陰性和相對(duì)于其他HPV基因型別陽性的風(fēng)險(xiǎn)，以及其他HPV基因型別陽性及HPV陽性相對(duì)于HPV陰性的風(fēng)險(xiǎn)。此外，HPV陰性人群的絕對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值應(yīng)足夠低；同時(shí)計(jì)算受試人群總體的≥CIN2絕對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值和≥CIN3絕對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值。

此項(xiàng)臨床試驗(yàn)的入組人群同樣應(yīng)在適用的年齡范圍內(nèi)的不同年齡段均有分布（<30、30～39和40以上），且各年齡段人群均具有一定數(shù)量，特別是當(dāng)該預(yù)期用途適用于30歲以下人群時(shí)，該年齡段應(yīng)有一定的陽性樣本量，并針對(duì)該年齡段單獨(dú)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以驗(yàn)證該試劑的初篩性能。樣本例數(shù)、脫落比例的要求可參考上述第1.2.2條。

綜上，申請人應(yīng)分別從HPV核酸檢測準(zhǔn)確性和臨床意義兩方面評(píng)價(jià)產(chǎn)品的臨床性能。若臨床試驗(yàn)未得到有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，申請人應(yīng)考慮陽性判斷值設(shè)置是否科學(xué)，受試者入組標(biāo)準(zhǔn)是否存在偏差，受試者例數(shù)是否足夠，病例脫落比例是否可以接受，或者隨訪年限是否需要延長等因素。同時(shí)，值得注意的是，臨床試驗(yàn)的結(jié)果需綜合評(píng)價(jià)，除了有關(guān)靈敏度、特異性、預(yù)期值、似然比、風(fēng)險(xiǎn)值的評(píng)價(jià)以外，HPV陽性率及CIN發(fā)病率等的統(tǒng)計(jì)同樣重要，應(yīng)符合客觀規(guī)律。

2.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇

應(yīng)選擇不少于3家（含3家）臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)、指導(dǎo)原則的要求開展臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局資質(zhì)認(rèn)可，其選擇應(yīng)盡量考慮擬申報(bào)產(chǎn)品的特點(diǎn)和預(yù)期用途，綜合流行病學(xué)背景，使臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)和受試者的選擇具有一定的地域代表性。且臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉評(píng)價(jià)方案。

3.倫理學(xué)要求

臨床試驗(yàn)必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則,必須獲得臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的同意。研究者應(yīng)考慮臨床試驗(yàn)用樣本的獲得和試驗(yàn)結(jié)果對(duì)受試者的風(fēng)險(xiǎn)性，應(yīng)提交倫理委員會(huì)的審查意見及受試者的知情同意書。

4.臨床試驗(yàn)方案

開展臨床試驗(yàn)前，申請人應(yīng)與各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)協(xié)商制定統(tǒng)一的、科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)方案，并按照臨床試驗(yàn)方案組織制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并進(jìn)行驗(yàn)證，以確保臨床試驗(yàn)操作在各個(gè)臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)之間的一致性。在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中均應(yīng)遵循預(yù)定的方案，不可隨意改動(dòng)。臨床試驗(yàn)應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗(yàn)操作過程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性，并在臨床試驗(yàn)方案中詳細(xì)說明樣本編盲和揭盲的操作流程。

關(guān)于比較研究試驗(yàn)，各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比方法和結(jié)果不符樣本的確認(rèn)方法應(yīng)一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；臨床試驗(yàn)中涉及宮頸細(xì)胞學(xué)檢查、陰道鏡檢查及組織病理學(xué)檢查，應(yīng)采用統(tǒng)一判讀標(biāo)準(zhǔn)等手段，保持各臨床研究機(jī)構(gòu)間判讀的一致性；受試者隨訪中樣本脫落的判定標(biāo)準(zhǔn)以及試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)方法等亦應(yīng)在各臨床研究機(jī)構(gòu)間保持一致。以上內(nèi)容均應(yīng)在臨床試驗(yàn)方案中有明確、清晰的表述。

5.質(zhì)量控制

臨床試驗(yàn)開始前，應(yīng)進(jìn)行臨床試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)，以熟悉并掌握相關(guān)試驗(yàn)方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗(yàn)誤差。整個(gè)試驗(yàn)過程都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

6.臨床試驗(yàn)總結(jié)報(bào)告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。建議在臨床總結(jié)報(bào)告中對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。

6.1臨床試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及方案描述

6.1.1 臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

6.1.2 病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、不同年齡段人群的預(yù)期選擇例數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)、樣本編盲和揭盲的操作流程等。

6.1.3 樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

6.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、統(tǒng)計(jì)軟件、評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。

6.2 具體的臨床試驗(yàn)情況

6.2.1 臨床試驗(yàn)所用體外診斷試劑及儀器的名稱、批號(hào)、機(jī)型等信息。

6.2.2 對(duì)各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況、不同基因型分布情況進(jìn)行綜合，建議以列表或圖示方式列出各年齡組和各種基因型別的樣本例數(shù)。

6.2.3 質(zhì)量控制，試驗(yàn)人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、儀器校準(zhǔn)、質(zhì)控品運(yùn)行情況。

6.2.4 具體試驗(yàn)過程，樣本檢測、樣本長期保存、受試者宮頸細(xì)胞學(xué)檢查、陰道鏡檢查和組織病理學(xué)檢查、數(shù)據(jù)收集、結(jié)果不一致樣本的校驗(yàn)等；受試者隨訪的操作方法及病例脫落情況，及是否符合臨床試驗(yàn)方案。

6.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或其他合理方法驗(yàn)證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、對(duì)異常值或缺失值的處理、隨訪中病例脫落比例、研究過程中是否涉及對(duì)方案的修改。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

6.4 討論和結(jié)論

對(duì)總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡要分析試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請人產(chǎn)品研制、前期臨床評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。

HPV核酸檢測及基因分型試劑的產(chǎn)品性能指標(biāo)應(yīng)主要包括：物理性狀、試劑盒內(nèi)陰/陽性對(duì)照品（質(zhì)控品）的符合性、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。陽性參考品主要考察對(duì)試劑盒適用范圍內(nèi)不同基因型HPV的檢測能力，陰性參考品則重點(diǎn)對(duì)申報(bào)試劑的分析特異性進(jìn)行驗(yàn)證。

如果申報(bào)試劑已有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品發(fā)布，則申請人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢測要求。

按照《辦法》的規(guī)定，此類產(chǎn)品為第三類體外診斷試劑，申請人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求，附錄的編制應(yīng)符合相關(guān)編寫規(guī)范的要求。

（九）注冊檢驗(yàn)

根據(jù)《辦法》的要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊檢驗(yàn)。對(duì)于已經(jīng)有國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品的檢測項(xiàng)目，在注冊檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)采用相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品進(jìn)行注冊檢驗(yàn),對(duì)于目前尚無國家標(biāo)準(zhǔn)品的、參考品的項(xiàng)目，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立自己的參考品體系并提供相應(yīng)的企業(yè)參考品。

（十）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報(bào)最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，進(jìn)口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對(duì)HPV核酸檢測及基因分型試劑說明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明，以指導(dǎo)注冊申報(bào)人員更合理地完成說明書編制。

1.【預(yù)期用途】

HPV核酸檢測及基因分型試劑的臨床意義主要在于對(duì)婦女罹患宮頸疾病的風(fēng)險(xiǎn)程度提供信息，以便于臨床醫(yī)生結(jié)合病人的其他檢查結(jié)果進(jìn)行更加準(zhǔn)確的疾病判斷和科學(xué)的患者管理。

申請人應(yīng)根據(jù)相關(guān)臨床研究結(jié)果確定產(chǎn)品的預(yù)期用途。一般的，此類產(chǎn)品預(yù)期用途描述包含以下幾方面：

（1）該產(chǎn)品用于體外定性檢測女性宮頸樣本（如宮頸脫落上皮細(xì)胞或分泌物等）中高危型人乳頭瘤病毒（HPV）（列出具體能夠檢測的基因型）核酸（明確檢測靶物質(zhì)，如DNA、RNA）。明確該產(chǎn)品是否能夠鑒別HPV基因型。

（2）該類產(chǎn)品主要用于：

①篩查宮頸細(xì)胞學(xué)檢查為ASC-US（意義未確定的非典型鱗狀上皮細(xì)胞）結(jié)果的患者，以確定是否需要進(jìn)行陰道鏡檢查（以下簡稱ASC-US人群分流用途）；

②對(duì)于30歲及以上的女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，與宮頸細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合進(jìn)行宮頸癌篩查，此檢測結(jié)合細(xì)胞學(xué)病史和其他風(fēng)險(xiǎn)因素的評(píng)估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導(dǎo)患者的管理；

③對(duì)于某年齡段（根據(jù)臨床試驗(yàn)結(jié)果而定）女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，進(jìn)行宮頸癌篩查，此檢測結(jié)合細(xì)胞學(xué)病史和其他風(fēng)險(xiǎn)因素的評(píng)估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導(dǎo)患者的管理。

未做相關(guān)臨床試驗(yàn)的產(chǎn)品應(yīng)在此項(xiàng)下聲明：由于未做相關(guān)驗(yàn)證，本產(chǎn)品不能用于相關(guān)臨床預(yù)期用途（按照如上項(xiàng)目描述）。

（3）申請人應(yīng)在此項(xiàng)下強(qiáng)調(diào)：

①如申報(bào)產(chǎn)品不包含上述第（2）③條所述的預(yù)期用途，則申請人應(yīng)聲明：此檢測不能獨(dú)立或優(yōu)先于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查應(yīng)用，不推薦在任何年齡段的人群中單獨(dú)使用本檢測進(jìn)行宮頸癌篩查；此方法不能代替宮頸細(xì)胞學(xué)檢查。

②年齡＜30歲的女性中，HPV感染率很高，同時(shí)自主清除率也很高，因此對(duì)這部分人群，如宮頸細(xì)胞學(xué)檢查正常則不應(yīng)再采用HPV檢測進(jìn)行聯(lián)合篩查，建議僅采用宮頸細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行篩查，或參照上述第（2）③條所述進(jìn)行篩查。

③本試劑檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合宮頸細(xì)胞學(xué)檢查及其他相關(guān)醫(yī)學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合分析，不得單獨(dú)作為患者管理的依據(jù)。

④HPV核酸檢測試劑的應(yīng)用應(yīng)符合相關(guān)臨床診療和篩查指南的要求。

（4）此外申請人還應(yīng)就以下內(nèi)容進(jìn)行簡要介紹：

①臨床背景的介紹，包括病原體生物學(xué)特征，基因型劃分，感染后的臨床癥狀及該檢測的臨床意義等。著重說明HPV高危型感染與宮頸癌的相關(guān)性，描述應(yīng)客觀、科學(xué)、全面。

②說明申報(bào)產(chǎn)品選擇HPV基因型的依據(jù)和考慮。原則上建議選擇至少包含16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68基因型在內(nèi)的多基因型聯(lián)合檢測的設(shè)計(jì)方式，以保證該產(chǎn)品用于宮頸癌篩查及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的能力，亦可同時(shí)包含26、53、66、73、82型中的一個(gè)或數(shù)個(gè)型別。不建議包含其他低危型HPV。

2.【檢驗(yàn)原理】

詳細(xì)說明試劑盒技術(shù)原理，及核酸分離/純化方法、原理。說明檢測的靶基因座位、序列長度等；介紹引物及探針設(shè)計(jì)、不同樣品反應(yīng)體系（管）組合、對(duì)照品（質(zhì)控品）設(shè)置及熒光信號(hào)標(biāo)記等。如添加了相關(guān)的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理作適當(dāng)介紹。

3.【主要組成成份】

詳細(xì)說明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質(zhì)，應(yīng)說明其生物學(xué)來源、活性及其他特性；說明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。

試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測必須的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、貨號(hào)以及醫(yī)療器械注冊證號(hào)（如有）等詳細(xì)信息。當(dāng)試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分時(shí)，應(yīng)在此注明經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的如上信息。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

試劑盒的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等。應(yīng)與相應(yīng)的穩(wěn)定性研究結(jié)論一致。

5.【適用儀器】

所有適用的儀器型號(hào)，提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6.【樣本要求】

明確適用的樣本類型。并詳細(xì)描述樣本采集及預(yù)處理要求、運(yùn)輸要求、保存條件及期限等。特別是樣本采集所需設(shè)備及保存液，需特別明確供應(yīng)商、貨號(hào)及注冊證號(hào)（如有）。有關(guān)描述均應(yīng)建立在相關(guān)性能評(píng)價(jià)及穩(wěn)定性研究的基礎(chǔ)上。

樣本的取材及處理方式等若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵循，并在此處引用。

7.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：

7.1試劑配制方法、注意事項(xiàng)。

7.2核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)。對(duì)照品（質(zhì)控品）參與樣本核酸的平行提取的要求等。

7.3擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：各組分加樣體積、順序、相關(guān)注意事項(xiàng)等。

7.4逆轉(zhuǎn)錄過程（如涉及）的溫度和時(shí)間設(shè)置、PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置及相關(guān)注意事項(xiàng)。

7.5儀器設(shè)置：特殊參數(shù)，待測基因、內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇等。

7.6質(zhì)量控制：說明對(duì)照品（質(zhì)控品）的檢測要求。

8.【陽性判斷值】

簡要總結(jié)陽性判斷值研究方法及結(jié)論。

9.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合對(duì)照品（質(zhì)控品）以及樣本管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果，對(duì)所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。檢驗(yàn)結(jié)果的解釋應(yīng)以臨床試驗(yàn)結(jié)論為依據(jù)。如有適用的臨床診療或篩查指南，則應(yīng)在此項(xiàng)下引用，相應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果的解釋應(yīng)符合相關(guān)指南的要求。

10.【檢驗(yàn)方法的局限性】

應(yīng)至少包括如下描述：

（1）本試劑檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合宮頸細(xì)胞學(xué)檢查及其他相關(guān)醫(yī)學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合分析，不得單獨(dú)作為患者管理的依據(jù)。

（2）不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理、以及不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。

11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

詳述以下性能指標(biāo)：

（1）對(duì)相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品（如有）檢測的符合情況。

（2）最低檢測限：說明針對(duì)各種HPV基因型的最低檢出濃度，并簡單介紹最低檢測限的確定方法。

（3）企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品符合率，陽性/陰性參考品的組成、來源、濃度梯度設(shè)置以及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等信息。

（4）精密度：建議詳細(xì)描述針對(duì)各種HPV基因型，采用不同來源的樣本（如人工模擬樣本和臨床樣本）在各個(gè)濃度水平進(jìn)行的精密度評(píng)價(jià)結(jié)果，可采用列表形式描述。

（5）分析特異性：建議以列表方式說明驗(yàn)證的其他HPV基因型、相關(guān)病原體等的交叉反應(yīng)性及其驗(yàn)證濃度水平?？偨Y(jié)潛在干擾物質(zhì)的評(píng)價(jià)濃度水平及干擾情況。

（6）簡要描述臨床試驗(yàn)的基本信息、試驗(yàn)方法和結(jié)論。

12.【注意事項(xiàng)】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

（1）如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出生物安全性的警告。

（2）臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

（3）強(qiáng)調(diào)產(chǎn)品性能僅針對(duì)聲稱的適用樣本類型及【樣本要求】項(xiàng)下說明的樣本采集和處理方法（包括樣本采集液等）進(jìn)行了驗(yàn)證，其他樣本類型或樣本采集、處理方法不能保證產(chǎn)品性能。

三、名詞解釋

1.PCR-熒光探針法

在PCR過程中利用熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，并通過對(duì)熒光的采集和分析以達(dá)到對(duì)原始模板量進(jìn)行分析的PCR。

2.分析特異性（Analytical Specificity）

測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時(shí)只測量被測量物的能力。通常以一個(gè)被評(píng)估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫(yī)學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度。

注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應(yīng)物。

3.精密度（Precision）

在規(guī)定條件下，相互獨(dú)立的測試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得到的測量不精密度的數(shù)字形式表示，如標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

4.檢測限（Detection Limit, Limit of Detection）

樣品中以一定概率可被聲明與零有差異的被測量的最低值。

5.閾值循環(huán)數(shù)(Cycle threshold, Ct)

實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增過程中，反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)周期數(shù)。主要的計(jì)算方式是以擴(kuò)增過程前3到15個(gè)循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，當(dāng)熒光值超過閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)則為閾值循環(huán)數(shù)（Ct）。

6.內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）(Internal Control)

在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴(kuò)增的一段非靶序列分子，其目的是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結(jié)果不理想的原因。

7.意義未確定的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASC-US）

指不能肯定其形態(tài)特征及病變性質(zhì)的形態(tài)異常的鱗狀上皮細(xì)胞。

8.宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）

是一組病變的統(tǒng)稱，包括宮頸不典型增生和原位癌，為宮頸浸潤癌的癌前期病變。此類病變?nèi)韵抻趯m頸上皮層內(nèi)，未穿透基底膜，無間質(zhì)浸潤。